Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.
Abstract
Metabolomik ist eine Methodik zur Identifizierung und Quantifizierung vieler niedermolekularer Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte innerhalb einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs, einer biologischen Flüssigkeit oder eines Organismus. Die Metabolomik konzentriert sich traditionell auf wasserlösliche Metaboliten. Das wasserlösliche Metabolom ist das Endprodukt eines komplexen zellulären Netzwerks, das verschiedene genomische, epigenomische, transkriptomische, proteomische und Umweltfaktoren integriert. Daher bewertet die metabolomische Analyse direkt das Ergebnis der Wirkung für all diese Faktoren in einer Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb verschiedener Organismen. Einer dieser Organismen ist die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae, ein einzelliger Eukaryot mit dem vollständig sequenzierten Genom. Da S. cerevisiae für umfassende molekulare Analysen geeignet ist, wird es als Modell für die Sezierung von Mechanismen verwendet, die vielen biologischen Prozessen innerhalb der eukaryotischen Zelle zugrunde liegen. Eine vielseitige Analysemethode zur robusten, empfindlichen und genauen quantitativen Bewertung des wasserlöslichen Metaboloms würde die wesentliche Methodik zur Sezierung dieser Mechanismen liefern. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimierten Bedingungen der Stoffwechselaktivitätsabschreckung und wasserlöslichen Metabolitenextraktion aus S. cerevisiae-Zellen vor. Das Protokoll beschreibt auch den Einsatz der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur quantitativen Analyse der extrahierten wasserlöslichen Metaboliten. Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen dieser Metaboliten. Zu diesen Metaboliten gehören verschiedene Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Zwischenprodukte des Tricarbonzyklus. Die LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist sensibel und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol/μL. Die Methode wurde erfolgreich zur Beurteilung wasserlöslicher Metabolome von Wildtyp- und mutierten Hefezellen eingesetzt, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.
Introduction
Wasserlösliche Metaboliten sind niedermolekulare Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte, die zu essentiellen zellulären Prozessen beitragen. Diese evolutionär konservierten Prozesse umfassen die Umwandlung von Nährstoffen in nutzbare Energie, die Synthese von Makromolekülen, Zellwachstum und -signalisierung, Zellzykluskontrolle, Regulierung der Genexpression, Stressreaktion, postkonlationale Regulierung des Stoffwechsels, Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktionalität, vesikulärer Zelltransport, Autophagie, Zellalterung und regulierter Zelltod1,2,3.
Viele dieser wesentlichen Rollen wasserlöslicher Metaboliten wurden durch Studien in der Knospenhefe S. cerevisiae1, 3,4,7,9,14,15 , 16,17,18,19,20,21,22entdeckt. Dieser einzellige Eukaryot ist ein nützlicher Modellorganismus zur Sezierung von Mechanismen, durch die wasserlösliche Metaboliten aufgrund seiner Zugänglichkeit zu fortgeschrittenen biochemischen, genetischen und molekularbiologischen Analysen zu zellulären Prozessen beitragen23,24,25,26. Obwohl die LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik zur Untersuchung der Rolle wasserlöslicher Metaboliten in knospenden Hefen3,18,22,27verwendetwurden,erfordert diese Art der Analyse die Verbesserung ihrer Vielseitigkeit, Robustheit, Empfindlichkeit und Fähigkeit, zwischen verschiedenen strukturellen Isomeren und stereoisomeren Formen dieser Metaboliten zu unterscheiden.
Die letzten Jahre sind geprägt von signifikanten Fortschritten bei der Anwendung der LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik auf die Profilierung wasserlöslicher Metaboliten in vivo. Viele Herausforderungen bei der Verwendung dieser Methodik bleiben jedoch2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Zu diesen Herausforderungen gehören die folgenden. Erstens liegen die intrazellulären Konzentrationen vieler wasserlöslicher Metaboliten unter einer Empfindlichkeitsschwelle für die derzeit verwendeten Methoden. Zweitens ist die Effizienz des Abschreckens der Stoffwechselaktivität zu gering und das Ausmaß der abschreckenden Zellleckage von intrazellulären Metaboliten ist für aktuelle Methoden zu hoch; Daher unterschätzen die derzeit verwendeten Methoden die intrazellulären Konzentrationen wasserlöslicher Metaboliten. Drittens können die bestehenden Methoden die strukturellen Isomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel, aber unterschiedlicher atomarer Konnektivität) oder Stereoisomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel und atomaren Konnektivität, aber mit der unterschiedlichen atomaren Anordnung im Raum) spezifischer Metaboliten nicht unterscheiden; Dies verhindert die korrekte Annotation bestimmter Metaboliten durch die derzeit verwendeten Methoden. Viertens sind die vorhandenen massenspektralen Online-Datenbanken von Elternionen (MS1) und Sekundärionen (MS2) unvollständig; dies wirkt sich auf die korrekte Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Metaboliten unter Verwendung der lc-MS/MS-Rohdaten aus, die mit Hilfe der aktuellen Methoden erzeugt wurden. Fünftens können die bestehenden Methoden keine einzige Art der Metabolitenextraktion verwenden, um alle oder die meisten Klassen von wasserlöslichen Metaboliten wiederherzustellen. Sechstens können die bestehenden Methoden nicht einen einzigen Typ der LC-Säule verwenden, um alle oder die meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten voneinander zu trennen.
Hier optimierten wir die Bedingungen für das Abschrecken der Stoffwechselaktivität in S. cerevisiae-Zellen, die Aufrechterhaltung der meisten wasserlöslichen Metaboliten in diesen Zellen vor der Extraktion und die Extraktion der meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten aus Hefezellen. Wir haben eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode zur LC-MS/MS-basierten Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten aus S. cerevisiae-Zellen entwickelt. Diese Methode der nicht zielgerichteten Metabolomik ermöglicht es, die intrazellulären Konzentrationen verschiedener Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Tricarbonsäurezyklus-Zwischenprodukte zu beurteilen. Die entwickelte LC-MS/MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen wasserlöslicher Metaboliten mit vielfältigen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um das hier beschriebene Protokoll erfolgreich zu verwenden, befolgen Sie die unten beschriebenen vorbeugenden Maßnahmen. Chloroform und Methanol extrahieren verschiedene Substanzen aus Laborkunststoffen. Behandeln Sie sie daher mit Vorsicht. Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten, die Kontakt mit einem dieser beiden organischen Lösungsmittel beinhalten. Verwenden Sie für diese Schritte Borosilikatglaspipetten. Diese Pipetten vor Gebrauch mit Chloroform und Methanol aufsteigen lassen. Verwenden Sie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Gespräche. Wir danken dem Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, dem Centre for Structural and Functional Genomics und dem Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alle an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada (RGPIN 2014-04482 und CRDPJ 515900 – 17) unterstützt. K.M. wurde durch das Concordia University Armand C. Archambault Fellowship und den Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence unterstützt.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
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