Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Summary

Vi presenterer en protokoll for identifisering og kvantifisering av store klasser av vannløselige metabolitter i gjæren Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metoden er allsidig, robust og sensitiv. Det tillater separasjon av strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vannløselige metabolitter fra hverandre.

Abstract

Metabolomics er en metodikk som brukes for identifisering og kvantifisering av mange lavmolekylære mellomprodukter og produkter av metabolisme i en celle, vev, organ, biologisk væske eller organisme. Metabolomics fokuserer tradisjonelt på vannløselige metabolitter. Den vannløselige metabolome er det endelige produktet av et komplekst mobilnettverk som integrerer ulike genomiske, epigenomiske, transkripsjons-, proteomiske og miljømessige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analysen direkte utfallet av handlingen for alle disse faktorene i en mengde biologiske prosesser innenfor ulike organismer. En av disse organismene er den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae, en encellulær eukaryote med det fullt sekvenserte genomet. Fordi S. cerevisiae er egnet til omfattende molekylære analyser, brukes den som modell for dissekeringsmekanismer som ligger til grunn for mange biologiske prosesser i den eukaryote cellen. En allsidig analytisk metode for den robuste, sensitive og nøyaktige kvantitative vurderingen av det vannløselige metabolomet vil gi den essensielle metodikken for dissekering av disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for optimaliserte forhold for metabolsk aktivitet slukking i og vannløselig metabolittutvinning fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av de ekstraherte vannløselige metabolittene. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk som er beskrevet her, er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper, inkludert forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for disse metabolittene. Disse metabolittene inkluderer ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk er følsom og tillater identifisering og kvantifisering av noen vannløselige metabolitter ved konsentrasjoner så lave som 0,05 pmol/μL. Metoden har blitt vellykket brukt til å vurdere vannløselige metabolomer av villtype og mutant gjærceller dyrket under forskjellige forhold.

Introduction

Vannløselige metabolitter er lavmolekylære mellomprodukter og produkter av metabolisme som bidrar til essensielle cellulære prosesser. Disse evolusjonært bevarte prosessene inkluderer konvertering av næringsstoffer til brukbar energi, syntese av makromolekyler, cellulær vekst og signalering, cellesykluskontroll, regulering av genuttrykk, stressrespons, postoversettelsesregulering av metabolisme, vedlikehold av mitokondriefunksjonalitet, bilikulær smugling, autofagi, cellulær aldring og regulert celledød^1,2,3.

Mange av disse viktige rollene til vannløselige metabolitter har blitt oppdaget av studier i den spirende gjæren S. cerevisiae^{1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Denne encellede eukaryotten er en nyttig modellorganisme for dissekeringsmekanismer der vannløselige metabolitter bidrar til cellulære prosesser på grunn av dens egnethet til avanserte biokjemiske, genetiske og molekylære biologiske analyser^23,24,25,26. Selv om LC-MS / MS-metodene for ikke-målrettet metabolomics har blitt brukt til å studere rollene til vannløselige metabolitter i spirende gjær^3,18,22,27, krever denne typen analyse forbedring av allsidigheten, robustheten, følsomheten og evnen til å skille mellom forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for disse metabolittene.

De siste årene er preget av betydelige fremskritt i å anvende LC-MS / MS metoder for ikke-målrettet metabolomics til profilering av vannløselige metabolitter in vivo. Mange utfordringer ved bruk av denne metodikken er imidlertid^{fortsatt 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36}. Disse utfordringene inkluderer følgende. For det første er de intracellulære konsentrasjonene av mange vannløselige metabolitter under en terskel for følsomhet for de for tiden brukte metodene. For det andre er effektiviteten av metabolsk aktivitetsslukking for lav, og omfanget av slukke-assosiert cellelekkasje av intracellulære metabolitter er for høy for dagens metoder; Derfor undervurderer de for tiden brukte metodene de intracellulære konsentrasjonene av vannløselige metabolitter. For det tredje kan de eksisterende metodene ikke skille de strukturelle isomerene (dvs. molekyler med samme kjemiske formel, men forskjellige atomforbindelser) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samme kjemiske formel og atomforbindelse, men med det forskjellige atomarrangementet i rommet) av spesifikke metabolitter; Dette forhindrer riktig merknad av visse metabolitter ved dagens brukte metoder. For det fjerde er de eksisterende elektroniske massespektraldatabasene for overordnede ioner (MS1) og sekundære ioner (MS2) ufullstendige. Dette påvirker riktig identifisering og kvantifisering av spesifikke metabolitter ved hjelp av rå LC-MS / MS-data produsert ved hjelp av de nåværende metodene. For det femte kan de eksisterende metodene ikke bruke en enkelt type metabolittutvinning for å gjenopprette alle eller de fleste klasser av vannløselige metabolitter. For det sjette kan de eksisterende metodene ikke bruke en enkelt type LC-kolonne for å skille seg fra hverandre alle eller de fleste klasser av vannløselige metabolitter.

Her optimaliserte vi forhold for slukking av metabolsk aktivitet i S. cerevisiae celler, opprettholde de fleste vannløselige metabolitter i disse cellene før utvinning, og trekke ut de fleste klasser av vannløselige metabolitter fra gjærceller. Vi utviklet en allsidig, robust og sensitiv metode for LC-MS/MS-basert identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter ekstrahert fra S. cerevisiae celler. Denne metoden for ikke-målrettede metabolomics gjør det mulig å vurdere intracellulære konsentrasjoner av ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. Den utviklede LC-MS/MS-metoden tillater identifisering og kvantifisering av forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper.

Protocol

1. Å lage og sterilisere et medium for dyrking av gjær Lag 180 ml av et komplett gjærekstrakt med bactopeptone (YP) medium. Det komplette YP-mediet inneholder 1% (w / v) gjærekstrakt og 2% (w / v) bactopeptone. Fordel 180 ml av YP-mediet likt i fire 250 ml Erlenmeyer-kolber. Hver av disse kolbeene inneholder 45 ml av YP-mediet. Steriliser kolbeene med YP-medium ved autoklavering ved 15 psi/121 °C i 45 minutter. 2. Gjærstamme av vill type Bruk…

Representative Results

For å forbedre en kvantitativ vurdering av vannløselige metabolitter i en gjærcelle, optimaliserte vi betingelsene for celleslukking for metabolittdeteksjon. Celleslukking for dette formålet innebærer en rask arrestasjon av alle enzymatiske reaksjoner i en celle31,33,37,38. En slik arrestasjon av cellulær metabolsk aktivitet er et viktig trinn i enhver met…

Discussion

Følg de forebyggende tiltakene som er beskrevet nedenfor for å kunne bruke protokollen som er beskrevet nedenfor. Kloroform og metanolekstrakt ulike stoffer fra laboratorieplastikk. Vær derfor forsiktig når du håndterer dem. Unngå bruk av plast i trinn som innebærer kontakt med noen av disse to organiske løsningsmidlene. Bruk borosilikatglasspipetter for disse trinnene. Øk disse pipettene med kloroform og metanol før bruk. Bruk kun mikropipettespisser og rør laget av polypropylen som er motstandsdyktige mot or…

Materials

Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049