प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल।
Summary
यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क डिजनरेशन का अनुकरण करने के लिए प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी गोजातीय अंग संस्कृति का एक उपन्यास प्रयोगात्मक मॉडल प्रस्तुत करता है।
Abstract
रोगसूचक इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) डिजनरेशन (आइडी) एक प्रमुख सामाजिक आर्थिक बोझ है और सूजन और ऊतक क्षरण की विशेषता है। कारक चिकित्सा की कमी के कारण, इस रोग की प्रगति में शामिल तंत्र का अध्ययन करने, चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने और पशु मॉडलों की आवश्यकता को कम करने के लिए अभिनव प्रायोगिक अंग संस्कृति मॉडलों की तत्काल आवश्यकता है । हम यहां एक उपन्यास, त्रि-आयामी अंग संस्कृति मॉडल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रोइंफ्लेमेटरी और कैटाबोलिक माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करते हैं, जो आइडी के दौरान मौजूद है।
प्रारंभ में, गोजातीय कौडल आईवीडी को ऊतक संस्कृति माध्यम में विच्छेदित, साफ और सुसंस्कृत किया गया था। डायनेमिक फिजियोलॉजिकल या पैथोलॉजिकल लोडिंग को प्रति दिन 2 घंटे के लिए कस्टम-मेड बायोरिएक्टर में लागू किया गया था। आईवीडी को चार दिनों के लिए एक नियंत्रण समूह (उच्च ग्लूकोज माध्यम, शारीरिक लोडिंग, फॉस्फेट-बफर खारा इंजेक्शन) और एक पैथोलॉजिकल समूह (कम ग्लूकोज माध्यम, रोग लोडिंग, ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा इंजेक्शन) को सौंपा गया था। वातानुकूलित अंग संस्कृति मीडिया के आईवीडी और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख की एकत्र नाभिक लुगद कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था।
हमारे डेटा ने नियंत्रण समूह की तुलना में पैथोलॉजिकल समूह में लोड होने के बाद भड़काऊ मार्कर और कम डिस्क हाइट्स की उच्च अभिव्यक्ति का पता चला। यह प्रोटोकॉल आईवीडी सूजन और पतन का अनुकरण करने के लिए विश्वसनीय है और इसके आवेदन दायरे को व्यापक बनाने के लिए आगे विस्तार किया जा सकता है।
Introduction
कम पीठ दर्द (एलबीपी) सभी उम्र के व्यक्तियों को प्रभावित कर सकता है और दुनिया भर में विकलांगता का एक प्रमुख कारण है1,2,3. एलबीपी से जुड़ी कुल लागत प्रति वर्ष 100 बिलियन डॉलर से अधिक है,5. रोगसूचक इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) अध: पतन (आइडी), सूजन और ऊतक क्षरण की विशेषता वाली स्थिति,एलबीपी 6,7का एक प्रमुख कारण है। विशेष रूप से, आइडी को आईवीडी के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के धीरे-धीरे विकसित होने वाले टूटने की विशेषता है, जो कई कारकों से प्रेरित और ट्रिगर होता है जो त्वरित विकृति, न्यूरोलॉजिकल विकारों और अंततः विकलांगता का कारण बनता है। इसके अलावा, आइडी प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स, बदल रीढ़ बायोमैकेनिक्स, एंजियोजेनेसिस और तंत्रिका अंतर्वृद्धि की रिहाई से जुड़ा हुआ है, जो दर्द सनसनी को बढ़ाता है, पूरी तरह से क्रोनिक एलबीपी (सक्रिय डिस्कोथंडी)6,8का कारण बनता है। आज तक, उपचार विकल्पों में आसन्न कशेरुकी के डिस्केक्टॉमी और बाद में संलयन, आईवीडी कृत्रिम अंग का प्रत्यारोपण, या गैर-शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण, जैसे गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाएं, ओपिओइड, औरआइडी 9वाले रोगियों के लिए मांसपेशियों में आराम करने वाले शामिल हैं। दोनों वर्तमान मानक चिकित्सीय विकल्प, शल्य चिकित्सा और गैर शल्य चिकित्सा, केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अंतर्निहित जैविक समस्या9,10को संबोधित करने में विफल रहे हैं । प्रारंभिक चरण अपक्षयी डिस्क रोग एक प्रारंभिक भड़काऊ ऊतक प्रतिक्रिया की विशेषता है, विशेष रूप से ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (टीएनएफ-अल्फा) अभिव्यक्ति11में वृद्धि। ये प्रारंभिक डिस्क परिवर्तन मुख्य रूप से डिस्क वास्तुकला को बाधित किए बिना सेलुलर स्तर पर होते हैं और पहले12समर्थक भड़काऊ स्थितियों के तहत पोषण की कमी से नकल की जा सकती थी। इसलिए, इन पतन तंत्रों की जांच करने और उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने के लिए वीवो स्थिति का सटीक अनुकरण महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, आणविक गुणों के इन सिमुलेशन के लिए, डिस्क का यांत्रिक लोडिंग वातावरण आईवीडी के पैथोलॉजिकल और शारीरिक परिवर्तनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। नतीजतन, इन दृष्टिकोणों के संयोजन से हमें वीवो में आईवीडी के जटिल माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए एक कदम आगे लाया जा सकेगा । वर्तमान में हमारे ज्ञान के सर्वश्रेष्ठ करने के लिए समर्थक भड़काऊ और पोषण सेटिंग के साथ गतिशील लोडिंग के पहलू पर विचार करने वाले कोई अध्ययन नहीं हैं।
हालांकि बड़े पशु मॉडल वीवो इंटरैक्शन में प्रासंगिक संभावित की जांच की अनुमति देते हैं, वे महंगे होते हैं और गहन काम करते हैं। इसके अलावा, चूंकि अनुसंधान में पशु मॉडलों का उपयोग लंबे समय से विवाद का विषय रहा है, इसलिए महत्वपूर्ण शोध प्रश्नों के उत्तर देने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी काफी रुचि है । अंत में, आईवीडी अनुसंधान13,14में आइडी की नकल करने के लिए वर्तमान में कोई आदर्श पशु मॉडल नहीं है। इसलिए, आइडी और संबद्ध भड़काऊ और अपक्षयी प्रक्रियाओं का अनुकरण करने के लिए एक अंग संस्कृति मॉडल जैसे लागत प्रभावी और विश्वसनीय प्रतिस्थापन स्थापित करना आवश्यक है। हाल ही में, प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी और अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल की स्थापना पर वर्तमान प्रोटोकॉल के आवेदन ने हमें आइडी अंग संस्कृति15में विरोधी भड़काऊ दवाओं के प्रभाव की जांच करने की अनुमति दी।
यहां, हम वर्णन करते हैं कि गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क कैसे प्राप्त करें और ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (टीएनएफ-α) के प्रत्यक्ष इंट्राडिस्कल इंजेक्शन के कारण एक कैटाबोलिक और प्रोइनफ्लेमेटर माइक्रोएनवायरमेंट के माध्यम से प्रारंभिक चरण की आइडी की स्थिति को प्रेरित करें और कम पोषक मध्यम परिस्थितियों में बायोरिएक्टर में अपक्षयी लोडिंग करें। चित्रा 1 प्रायोगिक मॉडल को दिखाता है और अपक्षयी और शारीरिक लोडिंग स्थितियों का अनुकरण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर को दिखाता है।
चित्र 1:प्रायोगिक सेटअप का चित्रण। एक:गोजातीय पूंछ; बी:विच्छेदित गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क; सी:डिस्क का संस्कृति माध्यम के साथ एक अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करना; घ:एक बायोरिएक्टर में सिमुलेशन लोड करना; ई:इंट्राडिस्कल इंजेक्शन तकनीक; एफ:वितरण प्रकट करने के लिए पीबीएस/ट्राइपैन ब्लू डाई के इंजेक्शन के बाद आईवीडी । आइडी: इंटरवर्टेब्रल डिस्क डिजनरेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने यहां अपक्षयी और भड़काऊ आईवीडीडी का अनुकरण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस प्रोटोकॉल को भड़काऊ रास्तों की विस्तृत परीक्षाओं के लिए लागू किया जा सकता है जिससे डिस्क पर विनाशका?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एओ फाउंडेशन और एओस्पिन इंटरनेशनल ने सपोर्ट किया । बाबाक सरवी को जर्मन स्पाइन फाउंडेशन और जर्मन ऑस्टियोआर्थराइटिस फाउंडेशन से फैलोशिप सपोर्ट मिला । गेर्नोट लैंग को उन्नत चिकित्सकीय वैज्ञानिकों, चिकित्सा संकाय, फ्रीबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी के लिए बर्टा-ओटेनस्टीन-कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
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