Um modelo de cultura de órgãos proinflamatório e degenerativo para simular a doença do disco intervertebral em estágio inicial.

Summary

Este protocolo apresenta um novo modelo experimental de cultura de órgãos bovinos proinflammatórios e degenerativos para simular a degeneração do disco intervertebral em estágio inicial.

Abstract

A degeneração do disco intervertebral sintomático (IVD) é uma grande carga socioeconômica e é caracterizada por inflamação e degradação tecidual. Devido à falta de terapias causais, há necessidade urgente de modelos inovadores de cultura de órgãos experimentais para estudar os mecanismos envolvidos na progressão da doença, encontrar metas terapêuticas e reduzir a necessidade de modelos animais. Apresentamos aqui um novo protocolo de modelo de cultura de órgãos tridimensional imitando o microambiente proinflammatório e catabólico, que está presente durante o IDD.

Inicialmente, foram dissecadas, limpas e cultivadas no meio de cultura de tecido. O carregamento fisiológico ou patológico dinâmico foi aplicado em um bioreator personalizado durante 2 horas por dia. Os IVDs foram atribuídos a um grupo controle (alto meio de glicose, carregamento fisiológico, injeção salina tamponada com fosfato) e um grupo patológico (baixo meio de glicose, carregamento patológico, injeção fator de necrose tumoral-alfa) por quatro dias. Foi realizada a análise da expressão genética das células pulposus do núcleo coletado dos IVDs e do ensaio imunosorbente ligado à enzima dos meios de cultura de órgãos condicionados.

Nossos dados revelaram maior expressão de marcadores inflamatórios e alturas de disco reduzidas após o carregamento no grupo patológico em comparação com o grupo controle. Este protocolo é confiável para simular inflamação e degeneração do IVD e pode ser expandido ainda mais para ampliar seu escopo de aplicação.

Introduction

Dor lombar (LBP) pode afetar indivíduos de todas as idades e é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo^1,2,3. O custo total associado ao LBP excede US$ 100 bilhões por ano^4,5. A degeneração do disco intervertebral sintomático (IVD), condição caracterizada pela inflamação e degradação tecidual, é uma das principais causas da LBP^6,7. Especificamente, o IDD é caracterizado por uma gradual evolução da matriz extracelular do IVD (ECM), induzida e desencadeada por múltiplos fatores que levam a uma patologia acelerada, distúrbios neurológicos e eventualmente incapacidade. Além disso, o IDD está associado à liberação de citocinas proinflamatórias, biomecânica alterada da coluna vertebral, angiogênese e crescimento nervoso, o que aumenta a sensação de dor, causando totalmente LBP crônica (descoltidão ativa)^6,8. Até o momento, as opções de tratamento incluem discectomia e posterior fusão das vértebras adjacentes, implantação de prótese intravenosa ou abordagens não cirúrgicas, como anti-inflamatórios não esteroides, opioides e relaxantes musculares para pacientes com IDD⁹. Ambas as opções terapêuticas padrão atuais, cirúrgicas e não cirúrgicas, são apenas parcialmente eficazes e não conseguem resolver o problema biológico subjacente^9,10. A doença do disco degenerativo em estágio inicial é caracterizada por uma resposta inicial do tecido inflamatório, especialmente um aumento na expressão fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa)¹¹. Essas alterações iniciais do disco ocorrem principalmente no nível celular sem interromper a arquitetura do disco e poderiam ser anteriormente imitadas por deficiência nutricional sob condições pró-inflamatórias¹². Portanto, a simulação precisa da situação in vivo para investigar esses mecanismos de degeneração e encontrar alvos terapêuticos adequados é crucial. Além disso, para essas simulações de propriedades moleculares, o ambiente de carregamento mecânico dos discos desempenha um papel fundamental nas alterações patológicas e fisiológicas do IVD. Consequentemente, a combinação dessas abordagens nos traria um passo à frente para imitar o complexo microambiente de IVDs in vivo. Atualmente, não há estudos considerando o aspecto do carregamento dinâmico, juntamente com o cenário pró-inflamatório e nutricional com o melhor de nosso conhecimento.

Embora grandes modelos animais permitam a investigação de potenciais interações in vivo relevantes, eles são caros e trabalham intensivos. Além disso, como o uso de modelos animais em pesquisas tem sido uma questão de controvérsia, a redução do número de animais necessários para responder a importantes questões de pesquisa é de grande interesse. Finalmente, atualmente não existe um modelo animal ideal para imitar o IDD na pesquisa ivd^13,14. Portanto, é necessário estabelecer uma substituição econômica e confiável, como um modelo de cultura de órgãos para simular IDD e processos inflamatórios e degenerativos associados. Recentemente, a aplicação do presente protocolo sobre o estabelecimento de um modelo de cultura proinflamatória e degenerativa de órgãos para simular a doença do disco intervertebral em estágio inicial permitiu investigar o efeito de drogas anti-inflamatórias na cultura de órgãos IDD¹⁵.

Aqui, descrevemos como obter discos interverteberais bovinos e induzir o estado de IDD em estágio inicial através de um microambiente catabólico e proinflamatório causado pela injeção intradiscal direta de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e carregamento degenerativo em um bioreator sob baixas condições nutritivas médias. A Figura 1 ilustra o modelo experimental e mostra o bioreator usado para simular condições de carga degenerativa e fisiológica.

Figura 1: Ilustração da configuração experimental. A: cauda bovina; B: discos intervertebrales bovinos dissecados; C: transferência do disco para um bem-prato com meio de cultura; D: carregar a simulação em um bioreator; E: técnica de injeção intradiscal; F: IVD após injeção de corante azul PBS/trypan para revelar a distribuição. IDD: degeneração do disco intervertebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Os experimentos foram realizados utilizando-se caudas bovinas obtidas de matadouros locais. Os materiais biológicos utilizados no presente estudo são retirados da cadeia alimentar e não requerem aprovação ética no direito suíço e europeu. 1. Dissecção do disco intervertebral bovino Enxágüe toda a cauda completamente com água da torneira para remover sujeira e cabelo na superfície.NOTA: Com extremidades distais intactas, um máximo de 9 IVDs (coccygeal 1-9) por cauda…

Representative Results

A carga degenerativa em meio de baixa glicose combinada com a injeção de TNF-α causou um aumento significativo da expressão genética dos marcadores proinflamatórios interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8 (IL-8) em comparação com o grupo de controle fisiológico em células NP após 4 dias de cultura(Figura 2). Em contraste, não observamos alterações significativas para os genes proinflamatórios interleucina 1β (IL-1β) e TNF-α em células NP (dados não mostrados). Além disso,…

Discussion

Nós fornecemos um protocolo detalhado para simular IVDs degenerativos e inflamatórios. Este protocolo pode ser aplicado para exames detalhados de vias inflamatórias que levam aos efeitos destrutivos no disco. Além disso, o protocolo pode ajudar a determinar alvos terapêuticos promissores envolvidos na progressão da doença.

Recentemente, mostramos que o α de α de recombinação humana poderia induzir inflamação nas células²¹bovinas e humanas, o que está de a…

Materials

1-Bromo-3-chloropropane(BCP)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	B9673
Ascorbate-2-phosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	A8960
Band saw	Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany	model 30/833
Betadine	Munndipharma, Frankfurt, Germany
Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	DIY1028B-003
Corning ITS Premix	Corning Inc., New York, USA	354350
DMEM high glucose	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM low glucose	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	09-0851
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
Non-essential amino acid solution	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11140050
Penicillin/Streptomycin(P/S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
Phosphate Buffer Solution, tablet	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P4417
Pronase	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	10165921001
Primocin	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05
Pulsavac Jet Lavage System	Zimmer, IN,USA
TissueLyser II	Quiagen, Venlo, Netherlands	85300
Streptavidinn-HRP	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	AR0068-001
Superscript VILO	Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA	10704274
cDNA Synthesis Kit	Applied Biosystems by life technologies	10400745
TaqMan Universal Master Mix	Applied Biosystems by life technologies
TNF-alpha, recombinant human protein	R&D systems, Minnesota, USA	210-TA-005
TRI Reagent	Molecular Research Center, Cincinnati, USA	TR 118
Tris-EDTA buffer solution	sigma-Aldrich, St. Louis, USA	93283
Gene bIL-6	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT
Gene bIL8	Applied Biosystems by life technologies	Bt03211906_m1
Gene bTNF-alpha	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G
GENE bIL1beta	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A
RPLP0	Applied Biosystems by life technologies	Bt03218086_m1