Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.
Summary
Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.
Abstract
La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD) (IDD) è un importante fardello socioeconomico ed è caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti. A causa della mancanza di terapie causali, c’è un’urgente necessità di modelli sperimentali innovativi di coltura degli organi per studiare i meccanismi coinvolti nella progressione della malattia, trovare obiettivi terapeutici e ridurre la necessità di modelli animali. Qui presentiamo un nuovo protocollo di modello tridimensionale di coltura di organi che imita il microambiente proinfiammatorio e catabolico, presente durante l’IDD.
Inizialmente, gli IVD caudali bovini venivano sezionati, puliti e coltivati nel mezzo di coltura tissutale. Il carico fisiologico dinamico o patologico è stato applicato in un bioreattore su misura per 2 ore al giorno. Gli IVD sono stati assegnati a un gruppo di controllo (mezzo di glucosio elevato, carico fisiologico, iniezione salina tamponata da fosfati) e a un gruppo patologico (mezzo a basso glucosio, carico patologico, iniezione di fattore di necrosi tumorale-alfa) per quattro giorni. È stata eseguita l’analisi dell’espressione genica da cellule pulpose del nucleo raccolte degli IVD e il saggio immunoassorbente legato all’enzima del supporto di coltura degli organi condizionati.
I nostri dati hanno rivelato una maggiore espressione di marcatori infiammatori e una riduzione dell’altezza del disco dopo il caricamento nel gruppo patologico rispetto al gruppo di controllo. Questo protocollo è affidabile per simulare l’infiammazione e la degenerazione dell’IVD e può essere ulteriormente ampliato per ampliare il suo ambito di applicazione.
Introduction
Lo loto antisoccito (LBP) può colpire individui di tutte le età ed è una delle principali cause di disabilità intutto il mondo 1,2,3. Il costo totale associato a LBP supera $ 100 miliardi all’anno4,5. La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD), una condizione caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti, è una delle principali cause di LBP6,7. In particolare, l’IDD è caratterizzato da una rottura in graduale evoluzione della matrice extracellulare (ECM) dell’IVD, indotta e innescata da molteplici fattori che portano a una patologia accelerata, disturbi neurologici ed eventualmente disabilità. Inoltre, l’IDD è associato al rilascio di citochine proinfiammatorie, biomeccanica della colonna vertebrale alterata, angiogenesi e crescita nervosa, che aumenta la sensazione di dolore, causando del tutto LBP cronico (discopatia attiva)6,8. Ad oggi, le opzioni di trattamento includono discectomia e successiva fusione delle vertebre adiacenti, impianto di una protesi IVD o approcci non chirurgici, come farmaci antinfiammatori non steroidei, oppioidi e rilassanti muscolari per pazienti con IDD9. Entrambe le attuali opzioni terapeutiche standard, chirurgiche e non chirurgiche, sono solo parzialmente efficaci e non riescono ad affrontare il problema biologicosottostante 9,10. La malattia degenerativa del disco in fase iniziale è caratterizzata da una risposta iniziale del tessuto infiammatorio, in particolare un aumento dell’espressione fattore-alfa della necrosi tumorale (TNF-alfa)11. Questi primi cambiamenti del disco si verificano principalmente a livello cellulare senza interrompere l’architettura del disco e potrebbero in precedenza essere mimicked da carenza nutrizionale in condizioni pro-infiammatorie12. Pertanto, è fondamentale una simulazione precisa della situazione in vivo per indagare questi meccanismi di degenerazione e trovare obiettivi terapeutici adeguati. Inoltre, a queste simulazioni di proprietà molecolari, l’ambiente di carico meccanico dei dischi gioca un ruolo chiave nei cambiamenti patologici e fisiologici dell’IVD. Di conseguenza, combinare questi approcci ci farebbe fare un passo avanti per imitare il complesso microambiente dei D IVD in vivo. Attualmente non ci sono studi che considerino al meglio l’aspetto del carico dinamico insieme all’ambiente pro-infiammatorio e nutrizionale.
Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni consentano di investigre potenziali interazioni in vivo pertinenti, sono costosi e richiede molto lavoro. Inoltre, poiché l’uso di modelli animali nella ricerca è stato a lungo oggetto di controversie, la riduzione del numero di animali necessari per rispondere a importanti domande di ricerca è di grande interesse. Infine, attualmente non esiste un modello animale ideale per imitare l’IDD nella ricerca IVD13,14. Pertanto, è necessario stabilire una sostituzione economica e affidabile, come un modello di coltura di organi per simulare l’IDD e i processi infiammatori e degenerativi associati. Recentemente, l’applicazione del presente protocollo sull’istituzione di un modello di coltura proinfiammatoria e degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale ci ha permesso di indagare l’effetto dei farmaci antinfiammatori nella coltura di organi IDD15.
Qui descriviamo come ottenere dischi intervertebrali bovini e induciamo lo stato di IDD in fase iniziale attraverso un microambiente catabolico e proinfiammatorio causato dall’iniezione intradiscale diretta di fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) e dal carico degenerativo in un bioreattore in condizioni medie nutritive basse. La figura 1 illustra il modello sperimentale e mostra il bioreattore utilizzato per simulare le condizioni di carico degenerative e fisiologiche.
Figura 1: Illustrazione dell’impostazione sperimentale. A: coda bovina; B: dischi intervertebrali bovini sezionati; C: trasferimento del disco su una piastra di pozzo con mezzo di coltura; D: caricamento della simulazione in un bioreattore; E: tecnica di iniezione intradiscale; F: IVD dopo iniezione di pbs/tripano colorante blu per rivelare la distribuzione. IDD: degenerazione del disco intervertebrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per simulare l’IVDD degenerativo e infiammatorio. Questo protocollo può essere applicato per esami dettagliati delle vie infiammatorie che portano agli effetti distruttivi sul disco. Inoltre, il protocollo può aiutare a determinare obiettivi terapeutici promettenti coinvolti nella progressione della malattia.
Recentemente abbiamo dimostrato che il TNF-α ricombinante umano potrebbe indurre infiammazione nelle cellule NP sia bovine che umane<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da AO Foundation e AOSpine International. Babak Saravi ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca Spine e della Fondazione tedesca per l’osteoartrite. Gernot Lang è stato sostenuto dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici avanzati, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Germania.
Materials
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
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