Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Summary

Este protocolo describe el proceso paso a paso para construir estimuladores eléctricos y magnéticos utilizados para estimular los tejidos biológicos. El protocolo incluye una directriz para simular campos computacionalmente eléctricos y magnéticos y la fabricación de dispositivos estimuladores.

Abstract

Los campos eléctricos (EF) y los campos magnéticos (MFs) han sido ampliamente utilizados por la ingeniería de tejidos para mejorar la dinámica celular como la proliferación, migración, diferenciación, morfología y síntesis molecular. Sin embargo, variables tales tiempos de fuerza y estimulación de estímulos deben considerarse al estimular las células, tejidos o andamios. Dado que los EF y los MFs varían según la respuesta celular, no está claro cómo construir dispositivos que generen estímulos biofísicos adecuados para estimular muestras biológicas. De hecho, hay una falta de evidencia con respecto al cálculo y distribución cuando se aplican estímulos biofísicos. Este protocolo se centra en el diseño y fabricación de dispositivos para generar EF y MFs e implementación de una metodología computacional para predecir la distribución de estímulos biofísicos dentro y fuera de muestras biológicas. El dispositivo EF estaba compuesto por dos electrodos paralelos de acero inoxidable situados en la parte superior e inferior de los cultivos biológicos. Los electrodos se conectaron a un oscilador para generar voltajes (50, 100, 150 y 200 Vp-p) a 60 kHz. El dispositivo MF se componía de una bobina, que estaba energizada con un transformador para generar una corriente (1 A) y voltaje (6 V) a 60 Hz. Se construyó un soporte de metacrilato de polimetilo para localizar los cultivos biológicos en medio de la bobina. La simulación computacional elucidaba la distribución homogénea de efs y MFs dentro y fuera de los tejidos biológicos. Este modelo computacional es una herramienta prometedora que puede modificar parámetros como voltajes, frecuencias, morfologías tisulares, tipos de placas de pozo, electrodos y tamaño de bobina para estimar los EFs y MFs para lograr una respuesta celular.

Introduction

Se ha demostrado que los EF y los MFs modifican la dinámica celular, estimulando la proliferación y aumentando la síntesis de las moléculas principales asociadas con la matriz extracelular de los tejidos^1. Estos estímulos biofísicos se pueden aplicar de diferentes maneras mediante el uso de ajustes y dispositivos específicos. En cuanto a los dispositivos para generar EF, los estimuladores directos de acoplamiento utilizan electrodos que están en contacto con muestras biológicas in vitro o implantadas directamente en tejidos de pacientes y animales in vivo^2; sin embargo, todavía hay limitaciones y deficiencias que incluyen biocompatibilidad insuficiente por los electrodos en contacto, cambios en los niveles de pH y oxígeno molecular¹. Por el contrario, los dispositivos de acoplamiento indirecto generan EF entre dos electrodos, que se colocan en paralelo a las muestras biológicas^3,permitiendo una técnica alternativa no invasiva para estimular muestras biológicas y evitar el contacto directo entre tejidos y electrodos. Este tipo de dispositivo se puede extrapolar a futuras aplicaciones clínicas para realizar procedimientos con una mínima invasión al paciente. En relación con los dispositivos que generan MFs, los estimuladores de acoplamiento inductivos crean una corriente eléctrica que varía el tiempo, que fluye a través de una bobina que se encuentra alrededor de los cultivos celulares^4,5. Por último, hay dispositivos combinados, que utilizan EFs y MFs estáticos para generar campos electromagnéticos transitorios^1. Dado que existen diferentes configuraciones para estimular muestras biológicas, es necesario considerar variables como la tensión y la frecuencia cuando se aplican estímulos biofísicos. El voltaje es una variable importante, ya que influye en el comportamiento de los tejidos biológicos; por ejemplo, se ha demostrado que la migración celular, la orientación y la expresión génica dependen de la amplitud de la tensión aplicada^{3,6,7,8,9,10.} La frecuencia juega un papel importante en la estimulación biofísica, ya que se ha demostrado que estos ocurren naturalmente in vivo. Se ha demostrado que las frecuencias altas y bajas tienen efectos beneficiosos en las células; especialmente, en los canales de calcio cerrados por voltaje de membrana celular o reticulum endoplasmático, que desencadenan diferentes vías de señalización en el nivel intracelular^1,7,11.

Según lo anterior, un dispositivo para generar EF consiste en un generador de voltaje conectado a dos capacitores paralelos^12. Este dispositivo fue implementado por Armstrong et al. para estimular tanto la tasa proliferativa como la síntesis molecular de los condrocitos^13. Una adaptación de este dispositivo fue realizada por Brighton et al. que modificaron las placas de cultivo celular perforando sus tapas superiores e inferiores. Los agujeros se llenaron con toboganes de cubierta, donde las gafas inferiores se utilizaban para cultivo de tejidos biológicos. Se colocaron electrodos en cada diapositiva de cubierta para generar efs^14. Este dispositivo se utilizó para estimular eléctricamente condrocitos, osteoblastos y explantas de cartílago, mostrando un aumento en la proliferación celular^14,15,16 y síntesis molecular^3,17. El dispositivo diseñado por Hartig et al. consistía en un generador de ondas y un amplificador de voltaje, que estaban conectados a capacitores paralelos. Los electrodos estaban hechos de acero inoxidable de alta calidad ubicados en una caja aislante. El dispositivo se utilizó para estimular los osteoblastos, mostrando un aumento significativo en la proliferación y secreción de proteínas^18. El dispositivo utilizado por Kim et al. consistía en un chip estimulador de corriente bifásico, que fue construido utilizando un proceso de fabricación de semiconductores complementarios de óxido metálico de alta tensión. Una placa de cultivo fue diseñada para cultivo de células sobre una superficie conductora con estimulación eléctrica. Los electrodos estaban recubiertos de oro sobre placas de silicio^19. Este dispositivo se utilizó para estimular los osteoblastos, mostrando un aumento en la proliferación y la síntesis del factor de crecimiento endotelial vascular^19,y estimulando la producción de actividad alcalina fosfatasa, deposición de calcio y proteínas morfogénicas óseas^20. Del mismo modo, este dispositivo se utilizó para estimular la tasa proliferativa y la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular de las células madre mesenquimales de médula ósea humana²¹. El dispositivo diseñado por Nakasuji et al. estaba compuesto por un generador de voltaje conectado a placas de platino. Los electrodos fueron construidos para medir el potencial eléctrico en 24 puntos diferentes. Este dispositivo se utilizó para estimular los condrocitos, mostrando que los EF no alteraron la morfología celular y aumentaron la proliferación y la síntesis molecular^22. El dispositivo utilizado por Au et al. consistía en una cámara de vidrio equipada con dos barras de carbono conectadas a un estimulador cardíaco con alambres de platino. Este estimulador se utilizó para estimular los cardiomiocitos y fibroblastos, mejorando la elongación celular y la alineación de fibroblastos^23.

Diferentes dispositivos MF se han fabricado sobre la base de bobinas Helmholtz para estimular varios tipos de muestras biológicas. Por ejemplo, las bobinas Helmholtz se han utilizado para estimular la proliferación y síntesis molecular de condrocitos^24,25,mejorar la síntesis proteoglycan de explantas de cartílago articular^26,mejorar la regulación genética relacionada con la formación ósea de células similares a osteoblastos^27,y aumentar la proliferación y expresión molecular de las células endoteliales²⁸. Las bobinas Helmholtz generan MFs a lo largo de dos bobinas ubicadas una delante de la otra. Las bobinas deben colocarse con una distancia igual al radio de las bobinas para garantizar un MF homogéneo. La desventaja de usar bobinas Helmholtz radica en las dimensiones de la bobina, ya que necesitan ser lo suficientemente grandes como para generar la intensidad MF requerida. Además, la distancia entre bobinas debe ser adecuada para garantizar una distribución homogénea de los MFs alrededor de los tejidos biológicos. Para evitar problemas causados por las bobinas Helmholtz, diferentes estudios se han centrado en la fabricación de bobinas solenoides. Las bobinas solenoides se basan en un tubo, que se enrolla con alambre de cobre para generar MFs. Las entradas de alambre de cobre se pueden conectar directamente a la toma de corriente o a una fuente de alimentación para energizar la bobina y crear MFs en el centro del solenoide. Cuantos más giros tenga la bobina, mayor será el MF generado. La magnitud MF también depende de la tensión y corriente aplicadas para energizar la bobina^29. Las bobinas solenoides se han utilizado para estimular magnéticamente diferentes tipos de células como HeLa, HEK293 y MCF7³⁰ o células madre mesenquimales^31.

Los dispositivos utilizados por diferentes autores no han considerado ni el tamaño adecuado de los electrodos ni la longitud correcta de la bobina para distribuir homogéneamente tanto los EFs como los MFs. Además, los dispositivos generan voltajes fijos y frecuencias, limitando su uso para estimular tejidos biológicos específicos. Por esta razón, en este protocolo se realiza una guía de simulación computacional para simular tanto sistemas capacitivos como bobinas para garantizar una distribución homogénea de efs y MFs sobre muestras biológicas, evitando el efecto borde. Además, se muestra que el diseño de circuitos electrónicos genera voltajes y frecuencia entre los electrodos y la bobina, creando EFs y MFs que superarán las limitaciones causadas por la impedancia de las placas y el aire del cultivo celular. Estas modificaciones permitirán la creación de biorreactores no invasivos y adaptativos para estimular cualquier tejido biológico.

Protocol

1. Simulación de EF y MFs NOTA: La simulación de efs y MFs se realizó en MULTIFÍSica COMSOL. Seleccione una configuración 2D axisymmétrica para representar tanto dominios eléctricos como magnéticos. En la configuración física, seleccione la interfaz corriente eléctrica para calcular los EFs en electrodos paralelos o la interfaz campo magnético para calcular los MFs alrededor de las bobinas. En la configuración del est…

Representative Results

Simulación computacionalLas distribuciones de efs y MFs se muestran en la figura 3. Por un lado, era posible observar la distribución homogénea de los EF en el sistema capacitivo(Figura 3A). El EF fue trazado para observar en detalle la magnitud del campo dentro de la muestra biológica (Figura 3B). Esta simulación fue útil para parametrizar el tamaño de los electrodos y fabricarlos para evitar el efecto b…

Discussion

Los tratamientos utilizados para curar diferentes patologías que afectan a los tejidos humanos son terapias farmacológicas³² o intervenciones quirúrgicas^33,que buscan aliviar el dolor localmente o reemplazar los tejidos afectados por explantas o trasplantes. Recientemente, la terapia celular autóloga se ha propuesto como una terapia alternativa para tratar los tejidos lesionados, donde las células están aisladas del paciente y expandidas, a través de técnicas in vit…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1