Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess zum Bau von elektrischen und magnetischen Stimulatoren, die zur Stimulierung biologischer Gewebe verwendet werden. Das Protokoll enthält eine Richtlinie zur Simulation von rechengestützten elektrischen und magnetischen Feldern und zur Herstellung von Stimulatoren.

Abstract

Elektrische Felder (EFs) und Magnetfelder (MFs) wurden von der Gewebetechnik häufig verwendet, um die Zelldynamik wie Proliferation, Migration, Differenzierung, Morphologie und molekulare Synthese zu verbessern. Variablen wie Reizstärke und Stimulationszeiten müssen jedoch bei der Stimulierung von Zellen, Geweben oder Gerüsten berücksichtigt werden. Angesichts der Unterschiedlichen von EFs und MFs je nach zellulärer Reaktion bleibt unklar, wie Geräte gebaut werden können, die angemessene biophysikalische Reize erzeugen, um biologische Proben zu stimulieren. Tatsächlich fehlt es an Beweisen für die Berechnung und Verteilung, wenn biophysikalische Reize angewendet werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Entwicklung und Herstellung von Geräten zur Erzeugung von EFs und MFs und die Implementierung einer Berechnungsmethode zur Vorhersage der biophysikalischen Reizverteilung innerhalb und außerhalb biologischer Proben. Das EF-Gerät bestand aus zwei parallelen Edelstahlelektroden, die sich oben und unten in biologischen Kulturen befinden. Elektroden wurden an einen Oszillator angeschlossen, um Spannungen (50, 100, 150 und 200 Vp-p) bei 60 kHz zu erzeugen. Die MF-Vorrichtung bestand aus einer Spule, die mit einem Transformator energetisiert wurde, um einen Strom (1 A) und eine Spannung (6 V) bei 60 Hz zu erzeugen. Eine Polymethylmethacrylat-Unterstützung wurde gebaut, um die biologischen Kulturen in der Mitte der Spule zu lokalisieren. Die Rechensimulation erläuterte die homogene Verteilung von EFs und MFs innerhalb und außerhalb von biologischem Gewebe. Dieses Rechenmodell ist ein vielversprechendes Werkzeug, das Parameter wie Spannungen, Frequenzen, Gewebemorphologien, Wellplattentypen, Elektroden und Spulengröße ändern kann, um die EFs und MFs zu schätzen, um eine zelluläre Reaktion zu erreichen.

Introduction

Es wurde gezeigt, dass EFs und MFs die Zelldynamik verändern, die Proliferation stimulieren und die Synthese der Hauptmoleküle erhöhen, die mit der extrazellulären Matrix von Geweben verbunden sind¹. Diese biophysikalischen Reize können auf unterschiedliche Weise angewendet werden, indem bestimmte Einstellungen und Geräte verwendet werden. In Bezug auf die Vorrichtungen zur Erzeugung von EFs verwenden direkt gekoppelte Stimulatoren Elektroden, die in Kontakt mit biologischen Proben in vitro stehen oder direkt in Gewebe von Patienten und Tieren in vivo²implantiert werden; Es gibt jedoch immer noch Einschränkungen und Mängel, die eine unzureichende Biokompatibilität durch die kontaktgebundenen Elektroden, Veränderungen des pH-Wertes und des molekularen Sauerstoffgehalts¹umfassen. Im Gegenteil, indirekte Kopplungsvorrichtungen erzeugen EFs zwischen zwei Elektroden, die parallel zu biologischen Proben³platziert werden, was eine nicht-invasive alternative Technik ermöglicht, um biologische Proben zu stimulieren und direkten Kontakt zwischen Geweben und Elektroden zu vermeiden. Diese Art von Gerät kann auf zukünftige klinische Anwendungen extrapoliert werden, um Verfahren mit minimaler Invasion für den Patienten durchzuführen. In Bezug auf Geräte, die MFs erzeugen, erzeugen induktive Koppelstimulatoren einen zeitverändernden elektrischen Strom, der durch eine Spule fließt, die sich um Zellkulturen^{befindet 4,5}. Schließlich gibt es kombinierte Geräte, die EFs und statische MFs verwenden, um transiente elektromagnetische Felder zu erzeugen¹. Da es unterschiedliche Konfigurationen gibt, um biologische Proben zu stimulieren, ist es notwendig, Variablen wie Spannung und Häufigkeit zu berücksichtigen, wenn biophysikalische Reize angewendet werden. Spannung ist eine wichtige Variable, da sie das Verhalten biologischer Gewebe beeinflusst; zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Zellmigration, Orientierung und Genexpression von der Amplitude der angelegten Spannung^3,6,7,^8,9,10abhängen. Frequenz spielt eine wichtige Rolle bei der biophysikalischen Stimulation, da nachgewiesen wurde, dass diese natürlich in vivo auftreten. Es wurde gezeigt, dass hohe und niedrige Frequenzen positive Auswirkungen auf Zellen haben; insbesondere in zellmembranspannungsverkabelten Calciumkanälen oder endoplasmatischem Retikulum, die unterschiedliche Signalwege auf intrazellululärer Ebene^1,7,11auslösen.

Nach den oben genannten, eine Vorrichtung zur Erzeugung von EFs besteht aus einem Spannungsgenerator mit zwei parallelen Kondensatoren¹²verbunden. Dieses Gerät wurde von Armstrong et al. implementiert, um sowohl die proliferative Rate als auch die molekulare Synthese von Chondrozyten¹³zu stimulieren. Eine Anpassung dieses Geräts wurde von Brighton et al. durchgeführt, die die Zellkultur-Well-Platten modifizierten, indem sie ihre oberen und unteren Deckel bohrten. Die Löcher wurden mit Deckrutschen gefüllt, wo die bodenbeschaffenen Gläser zur Kultur biologischen Gewebes verwendet wurden. Elektroden wurden auf jedem Abdeckungsschlitten platziert, um EFs¹⁴zu erzeugen. Dieses Gerät wurde verwendet, um Chondrozyten, Osteoblasten und Knorpelexplante elektrisch zu stimulieren, was eine Zunahme der Zellproliferation^14,15,16 und molekulare Synthese^3,17zeigt. Das von Hartig et al. entwickelte Gerät bestand aus einem Wellengenerator und einem Spannungsverstärker, die mit parallelen Kondensatoren verbunden waren. Elektroden wurden aus hochwertigem Edelstahl in einem Isoliergehäuse hergestellt. Das Gerät wurde verwendet, um Osteoblasten zu stimulieren, zeigt eine signifikante Zunahme der Proliferation und Proteinsekretion¹⁸. Das von Kim et al. verwendete Gerät bestand aus einem biphasischen Stromstimulatorchip, der mit einem Herstellungsverfahren von komplementären Halbleitern von Hochspannungsmetalloxid hergestellt wurde. Eine Kultur-Well-Platte wurde entwickelt, um Zellen über eine leitfähige Oberfläche mit elektrischer Stimulation zu kultivieren. Elektroden wurden in Gold über Siliziumplatten¹⁹beschichtet. Dieses Gerät wurde verwendet, um Osteoblasten zu stimulieren, zeigt eine Zunahme der Proliferation und die Synthese des vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor¹⁹, und stimulierung der Produktion von alkalischer Phosphatase-Aktivität, Kalziumablagerung und Knochen morphogene Proteine²⁰. In ähnlicher Weise wurde dieses Gerät verwendet, um die proliferative Rate und Expression des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors der mesenchymalen Stammzellen des menschlichen Knochenmarks zu stimulieren²¹. Das von Nakasuji et al. entworfene Gerät bestand aus einem Spannungsgenerator, der mit Platinplatten verbunden war. Elektroden wurden gebaut, um das elektrische Potenzial an 24 verschiedenen Punkten zu messen. Dieses Gerät wurde verwendet, um Chondrozyten zu stimulieren, zeigt, dass EFs nicht verändern Zellmorphologie und erhöhte Proliferation und molekulare Synthese²². Das von Au et al. verwendete Gerät bestand aus einer Glaskammer, die mit zwei Kohlenstoffstäben ausgestattet war, die mit einem Herzstimulator mit Platindrähten verbunden waren. Dieser Stimulator wurde verwendet, um Kardiomyozyten und Fibroblasten zu stimulieren, Die Zelldehnung und Fibroblastenausrichtung zu verbessern²³.

Verschiedene MF-Geräte wurden auf Basis von Helmholtz-Spulen hergestellt, um verschiedene Arten biologischer Proben zu stimulieren. Zum Beispiel, Helmholtz-Spulen wurden verwendet, um die Proliferation und molekulare Synthese von Chondrozyten^24,25zu stimulieren, die proteoglykanische Synthese von Gelenkknorpelexplanten²⁶zu verbessern, die Genupregulation im Zusammenhang mit der Knochenbildung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen zu verbessern²⁷, und die Proliferation und molekulare Expression von Endothelzellen zu erhöhen²⁸. Helmholtz-Spulen erzeugen MFs in zwei Spulen, die sich eine vor der anderen befinden. Die Spulen müssen mit einem Abstand in Höhe des Radius der Spulen platziert werden, um ein homogenes MF zu gewährleisten. Der Nachteil der Verwendung von Helmholtz-Spulen liegt in den Spulenabmessungen, da sie groß genug sein müssen, um die erforderliche MF-Intensität zu erzeugen. Darüber hinaus muss der Abstand zwischen den Spulen ausreichend sein, um eine homogene Verteilung von MFs um biologische Gewebe zu gewährleisten. Um Probleme zu vermeiden, die durch Helmholtz-Spulen verursacht werden, wurden verschiedene Studien auf die Herstellung von Magnetspulen konzentriert. Magnetspulen basieren auf einem Rohr, das mit Kupferdraht gewickelt wird, um MFs zu erzeugen. Kupferdrahteingänge können direkt an den Ausgang oder ein Netzteil angeschlossen werden, um die Spule zu beleben und MFs in der Mitte des Magneten zu erzeugen. Je mehr Umdrehungen die Spule hat, desto größer ist die MF erzeugt. Die MF-Magnitude hängt auch von der Spannung und dem Strom ab, die angewendet werden, um die Spule²⁹zu beleben. Magnetspulen wurden verwendet, um magnetisch verschiedene Arten von Zellen wie HeLa, HEK293 und MCF7³⁰ oder mesenchymale Stammzellen³¹zu stimulieren.

Geräte, die von verschiedenen Autoren verwendet werden, haben weder die angemessene Größe der Elektroden noch die richtige Länge der Spule berücksichtigt, um sowohl EFs als auch MFs homogen zu verteilen. Darüber hinaus erzeugen Geräte feste Spannungen und Frequenzen und begrenzen deren Verwendung, um bestimmte biologische Gewebe zu stimulieren. Aus diesem Grund wird in diesem Protokoll eine numerische Simulationsrichtlinie durchgeführt, um sowohl kapazitive Systeme als auch Spulen zu simulieren, um eine homogene Verteilung von EFs und MFs über biologische Proben zu gewährleisten und so den Kanteneffekt zu vermeiden. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Konstruktion von elektronischen Schaltungen Spannungen und Frequenz zwischen den Elektroden und der Spule erzeugt, wodurch EFs und MFs entstehen, die Einschränkungen überwinden, die durch impedanziert von Zellkultur-Wellplatten und Luft verursacht werden. Diese Modifikationen werden die Schaffung von nicht-invasiven und adaptiven Bioreaktoren ermöglichen, um jedes biologische Gewebe zu stimulieren.

Protocol

1. Simulation von EFs und MFs HINWEIS: Die Simulation von EFs und MFs wurde in COMSOL Multiphysics durchgeführt. Wählen Sie eine achsensymmetrische 2D-Konfiguration aus, um beide Domänen elektrisch und magnetisch darzustellen. Wählen Sie in der Physikkonfiguration entweder die Schnittstelle elektrischer Strom aus, um EFs in parallelen Elektroden zu berechnen, oder die Magnetfeldschnittstelle, um MFs um Spulen zu berechnen. Wä…

Representative Results

Computational SimulationDie Verteilungen von EFs und MFs sind in Abbildung 3dargestellt. Einerseits konnte die homogene Verteilung der EF im kapazitiven System beobachtet werden (Abbildung 3A). Der EF wurde dargestellt, um die Größe des Feldes innerhalb der biologischen Probe im Detail zu beobachten (Abbildung 3B). Diese Simulation war nützlich, um die Größe der Elektroden zu parametrisieren und herzustelle…

Discussion

Behandlungen zur Heilen verschiedener Pathologien, die menschliches Gewebe beeinflussen, sind pharmakologische Therapien³² oder chirurgische Eingriffe³³, die versuchen, Schmerzen lokal zu lindern oder betroffene Gewebe durch Explanten oder Transplantationen zu ersetzen. Kürzlich wurde eine autologe Zelltherapie als alternative Therapie zur Behandlung von verletztem Gewebe vorgeschlagen, bei der Zellen vom Patienten isoliert und durch In-vitro-Techniken erweitert werden, um…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1