Электрические и магнитные полевые устройства для стимуляции биологических тканей
Summary
Этот протокол описывает пошаговый процесс создания как электрических, так и магнитных стимуляторов, используемых для стимуляции биологических тканей. Протокол включает в себя руководство по имитации вычислительно электрических и магнитных полей и изготовлению стимулирующих устройств.
Abstract
Электрические поля (EFs) и магнитные поля (MFs) широко используются тканевой инженерией для улучшения динамики клеток, таких как пролиферацию, миграцию, дифференциацию, морфологию и молекулярный синтез. Тем не менее, переменные, такие стимулы силы и время стимуляции должны быть рассмотрены при стимулировании либо клетки, ткани или леса. Учитывая, что EFs и MFs различаются в зависимости от клеточной реакции, остается неясным, как построить устройства, которые генерируют адекватные биофизические стимулы для стимулирования биологических образцов. В самом деле, существует отсутствие доказательств в отношении расчета и распределения, когда биофизические стимулы применяются. Этот протокол ориентирован на разработку и изготовление устройств для создания EFs и MFs и внедрение вычислительной методологии для прогнозирования распределения биофизических стимулов внутри и за пределами биологических образцов. Устройство EF состояло из двух параллельных электродов из нержавеющей стали, расположенных в верхней и нижней части биологических культур. Электроды были подключены к осциллятору для генерации напряжения (50, 100, 150 и 200 Вт-р) при 60 кГц. Устройство MF состояло из катушки, которая была под напряжением с трансформатором для генерации тока (1 A) и напряжения (6 V) на 60 Гц. Для обнаружения биологических культур в середине катушки была построена полиметилметиловая метакрилатная опора. Вычислительное моделирование прояснения прояснения однородного распределения EFs и MFs внутри и снаружи биологических тканей. Эта вычислительная модель является перспективным инструментом, который может изменять параметры, такие как напряжение, частоты, морфологии тканей, типы пластин, электроды и размер катушки для оценки EFs и MFs для достижения клеточной реакции.
Introduction
Было показано, что EFs и MFs изменяют динамику клеток, стимулируя пролиферацию и увеличивая синтез основных молекул, связанных с внеклеточной матрицейтканей 1. Эти биофизические стимулы могут быть применены по-разному с помощью конкретных параметров и устройств. Что касается устройств для генерации EFs, прямые стимуляторы связи используют электроды, которые находятся в контакте с биологическими образцами in vitro или имплантированы непосредственно в ткани пациентов и животных in vivo2; однако, Есть еще ограничения и недостатки, которые включают в себя недостаточную биосовместимость электродов в контакте, изменения в рН и молекулярного уровня кислорода1. Напротив, косвенные устройства соединения генерируют ЭКФ между двумя электродами, которые размещаются параллельнобиологическим образцам 3, что позволяет неинвазивнойальтернативной технике стимулировать биологические образцы и избегать прямого контакта между тканями и электродами. Этот тип устройства может быть экстраполирован на будущие клинические приложения для выполнения процедур с минимальным вторжением к пациенту. По отношению к устройствам, которые генерируют MFs, индуктивные стимуляторы соединения создают изменяющий время электрический ток, который течет через катушку, которая находится вокругклеточных культур 4,5. Наконец, есть комбинированные устройства, которые используют EFs и статические MFs для генерации переходных электромагнитных полей1. Учитывая, что существуют различные конфигурации для стимулирования биологических образцов, необходимо учитывать такие переменные, как напряжение и частота при применении биофизических стимулов. Напряжение является важной переменной, так как влияет на поведение биологических тканей; например, было показано, что миграция клеток, ориентация и экспрессия геновзависят от амплитуды прикладного напряжения 3,6,7,8,9,10. Частота играет важную роль в биофизической стимуляции, так как было доказано, что они происходят естественно in vivo. Было продемонстрировано, что высокие и низкие частоты благотворно влияют на клетки; особенно, в клеточной мембране напряжения закрытых кальциевых каналов или эндоплазмической цитулум, которые вызывают различные сигнальные пути навнутриклеточном уровне 1,7,11.
Согласно вышеупомянутому, устройство для генерации ЭФ состоит из генератора напряжения, подключенного к двум параллельным конденсаторам12. Это устройство было реализовано Армстронгом и др., чтобы стимулировать как скорость распространения, так и молекулярный синтез хондроцитов13. Адаптация этого устройства была выполнена Брайтон и др., которые модифицировали клеточной культуры хорошо пластин путем бурения их верхней и нижней крышки. Отверстия были заполнены крышкой слайдов, где нижние очки были использованы для культуры биологических тканей. Электроды были размещены на каждом слайде крышки для создания EFs14. Это устройство было использовано для электрического стимулирования хондроцитов, остеобластов и хрящей explants, показывая увеличениепролиферации клеток 14,15,16 и молекулярного синтеза 3,17. Устройство, разработанное Hartig et al., состояло из волнового генератора и усилителя напряжения, которые были подключены к параллельным конденсаторам. Электроды были изготовлены из высококачественной нержавеющей стали, расположенной в изоляционной корпусе. Устройство было использовано для стимуляции остеобластов, показывая значительное увеличение пролиферации и секреции белка18. Устройство, используемое Кимом и др., состояло из двухфазного тока стимулятора чипа, который был построен с использованием производственного процесса дополнительных полупроводников высоковольтного оксида металла. Культура хорошо пластины была разработана для культуры клеток над проводимой поверхности с электрической стимуляции. Электроды были покрыты золотом над кремниевыми пластинами19. Это устройство было использовано для стимулирования остеобластов, показывая увеличение пролиферации и синтез сосудистого эндотелиальногофактора роста 19, и стимулирование производства щелочной активности фосфатазы, осаждения кальция и костных морфогенныхбелков 20. Аналогичным образом, это устройство было использовано для стимулирования скорости пролиферации и экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста мезенхимальных стволовых клеток21 костного мозгачеловека. Устройство, разработанное Nakasuji et al., состояло из генератора напряжения, подключенного к платиновым пластинам. Электроды были построены для измерения электрического потенциала в 24 различных точках. Это устройство было использовано для стимулирования хондроцитов, показывая, что EFs не изменили морфологию клеток и увеличение пролиферации и молекулярногосинтеза 22. Устройство, используемое Au et al., состояло из стеклянной камеры, оснащенной двумя углеродными стержнями, подключенными к стимулятору сердца с платиновыми проводами. Этот стимулятор был использован для стимулирования кардиомиоцитов и фибробластов, улучшение удлинения клеток и фибробластов выравнивание23.
Различные устройства MF были изготовлены на основе катушек Гельмгольца, чтобы стимулировать несколько типов биологических образцов. Например, катушки Гельмгольца были использованы для стимулирования пролиферации и молекулярногосинтеза хондроцитов 24,25, повышения протеогликан синтезасуставного хрящаexplants 26 , улучшить ген upregulation, связанные с формированием костей остеобласт-какклетки 27, и увеличение пролиферации и молекулярнойэкспрессии эндотелиальных клеток 28. Катушки Гельмгольца генерируют MFs в двух катушках, расположенных один перед другой. Катушки должны быть размещены на расстоянии, равном радиусу катушек, чтобы обеспечить однородный MF. Недостаток использования катушек Гельмгольца заключается в размерах катушки, потому что они должны быть достаточно большими, чтобы генерировать необходимую интенсивность MF. Кроме того, расстояние между катушками должно быть достаточным для обеспечения однородного распределения MFs вокруг биологических тканей. Чтобы избежать проблем, вызванных катушки Гельмгольца, различные исследования были сосредоточены на производстве соленоидных катушек. Соленоидные катушки основаны на трубке, которая рана с медной проволокой для создания MFs. Медный провод входы могут быть подключены непосредственно к розетке или питания для активизации катушки и создания MFs в центре соленоида. Чем больше поворотов катушки, тем больше MF генерируется. Величина MF также зависит от напряжения и тока, применяемого для активизации катушки29. Соленоидные катушки были использованы для стимуляции магнитно различных видов клеток, таких как HeLa, HEK293 и MCF730 или мезенхимальных стволовыхклеток 31.
Устройства, используемые различными авторами, не рассматривали ни адекватный размер электродов, ни правильную длину катушки, чтобы однородно распределять как EFs, так и MFs. Кроме того, устройства генерируют фиксированное напряжение и частоты, ограничивая их использование для стимулирования конкретных биологических тканей. По этой причине в этом протоколе выполняется вычислительное моделирование для имитации как емкостных систем, так и катушек для обеспечения однородного распределения ЭКФ и МФ по биологическим образцам, избегая эффекта края. Кроме того, показано, что конструкция электронных схем генерирует напряжение и частоту между электродами и катушками, создавая EFs и MFs, которые будут преодолевать ограничения, вызванные ограничением клеточной культуры хорошо пластин и воздуха. Эти изменения позволят создавать неинвазивные и адаптивные биореакторы для стимуляции любой биологической ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лечение, используемое для лечения различных патологий, которые влияют на ткани человекаявляются фармакологические методы лечения 32 или хирургические вмешательства 33, которые стремятся облегчить боль локально или заменить пораженные ткани с эксплантами или …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят финансовую поддержку, оказанную “Фонд Национального де Financiamiento пара ла Ciencia, Ла Текнология, y la Innovaci’n -Фонд Франсиско Хосе де Кальдас-Минсенсияс” и Национальный университет Колумбии через грант No 80740-290-2020 и поддержку, полученную Valteam Tech – Исследования и инновации для предоставления оборудования и технической поддержки в издании видео.
Materials
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | —- Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | —- | —- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | —- | —- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | —- | —- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | —- | —- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | —- | —- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | —- | —- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | —- | —- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | —- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | —- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | —- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT – T13 | —- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | —- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | —- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | —- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | —- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | —- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | —- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | —- | P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | —- | 4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1 |
| Case | —- | —- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | —- | —- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | —- | —- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | —- | —- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | —- | —- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | —- Quantity: 1 |
| Transformer | —- | —- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | —- | —- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
References
- Balint, R., Cassidy, N. J., Cartmell, S. H. Electrical Stimulation: A Novel Tool for Tissue Engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (1), 48-57 (2013).
- Ercan, B., Webster, T. J. The effect of biphasic electrical stimulation on osteoblast function at anodized nanotubular titanium surfaces. Biomaterials. 31 (13), 3684-3693 (2010).
- Brighton, C., Wang, W., Clark, C. The effect of electrical fields on gene and protein expression in human osteoarthritic cartilage explants. The Journal of Bone and Joint Surgery-American. 90 (4), 833-848 (2008).
- Baerov, R. M., Morega, A. M., Morega, M. Analysis of magnetotherapy effects for post-traumatic recovery of limb fractures. Revue Roumaine des Sciences Techniques- Série électrotechnique et énergétique. 65 (1-2), 145-150 (2020).
- Escobar, J. F., et al. In Vitro Evaluation of the Effect of Stimulation with Magnetic Fields on Chondrocytes. Bioelectromagnetics. 41 (1), 41-51 (2019).
- Brighton, C., Wang, W., Clark, C. Up-regulation of matrix in bovine articular cartilage explants by electric fields. Biochemical and Biophysical Research Communications. 342 (2), 556-561 (2006).
- Xu, J., Wang, W., Clark, C., Brighton, C. Signal transduction in electrically stimulated articular chondrocytes involves translocation of extracellular calcium through voltage-gated channels. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (3), 397-405 (2009).
- Xia, Y., et al. Magnetic field and nano-scaffolds with stem cells to enhance bone regeneration. Biomaterials. 183, 151-170 (2018).
- Richter, A., Bartoš, M., Ferková, &. #. 3. 8. 1. ;. Physical Analysis of Pulse Low-Dynamic Magnetic Field Applied in Physiotherapy BT. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering 2018. , 239-245 (2019).
- Miyakoshi, J. Effects of static magnetic fields at the cellular level. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 87, 213-223 (2005).
- Zhang, K., Guo, J., Ge, Z., Zhang, J. Nanosecond Pulsed Electric Fields (nsPEFs) Regulate Phenotypes of Chondrocytes through Wnt/β-catenin Signaling Pathway. Scientific Reports. 4 (5836), 1-8 (2014).
- Brighton, C. T., Unger, A. S., Stambough, J. L. In vitro growth of bovine articular cartilage chondrocytes in various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 15-22 (1984).
- Armstrong, P. F., Brighton, C., Star, A. M. Capacitively coupled electrical stimulation of bovine growth plate chondrocytes grown in pellet form. Journal of Orthopaedic Research. 6 (2), 265-271 (1988).
- Brighton, C., Townsend, P. Increased cAMP production after short-term capacitively coupled stimulation in bovine growth plate chondrocytes. Journal of Orthopaedic Research. 6 (4), 552-558 (1988).
- Brighton, C. T., Jensen, L., Pollack, S. R., Tolin, B. S., Clark, C. Proliferative and synthetic response of bovine growth plate chondrocytes to various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 7 (5), 759-765 (1989).
- Brighton, C. T., Okereke, E., Pollack, S. R., Clark, C. In vitro bone-cell response to a capacitively coupled electrical field. The role of field strength, pulse pattern, and duty cycle. Clinical Orthopaedics and Related Research. 285, 255-262 (1992).
- Wang, W., Wang, Z., Zhang, G., Clark, C., Brighton, C. T. Up-regulation of chondrocyte matrix genes and products by electric fields. Clinical Orthopaedics and Related Research. 427, 163-173 (2004).
- Hartig, M., Joos, U., Wiesmann, H. P. Capacitively coupled electric fields accelerate proliferation of osteoblast-like primary cells and increase bone extracellular matrix formation in vitro. European Biophysics Journal. 29 (7), 499-506 (2000).
- Kim, I. S., et al. Biphasic electric current stimulates proliferation and induces VEGF production in osteoblasts. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (9), 907-916 (2006).
- Kim, I., et al. Novel Effect of Biphasic Electric Current on In Vitro Osteogenesis and Cytokine Production in Human Mesenchymal Stromal Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 2411-2422 (2009).
- Kim, I., et al. Novel action of biphasic electric current in vitro osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stromal cells coupled with VEGF production. Bone. 43, 43-44 (2008).
- Nakasuji, S., Morita, Y., Tanaka, K., Tanaka, T., Nakamachi, E. Effect of pulse electric field stimulation on chondrocytes. Asian Pacific Conference for Materials and Mechanics. 1, 13-16 (2009).
- Au, H. T. H., Cheng, I., Chowdhury, M. F., Radisic, M. Interactive effects of surface topography and pulsatile electrical field stimulation on orientation and elongation of fibroblasts and cardiomyocytes. Biomaterials. 28 (29), 4277-4293 (2007).
- Vanessa, N., et al. In vitro exposure of human chondrocytes to pulsed electromagnetic fields. European Journal of Histochemistry. 51 (3), 203-211 (2007).
- Pezzetti, F., et al. Effects of pulsed electromagnetic fields on human chondrocytes: An in vitro study. Calcified Tissue International. 65 (5), 396-401 (1999).
- De Mattei, M., et al. Effects of electromagnetic fields on proteoglycan metabolism of bovine articular cartilage explants. Connective Tissue Research. 44 (3-4), 154-159 (2003).
- Sollazzo, V., Massari, L., Caruso, A., Mattei, M., Pezzetti, F. Effects of Low-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields on Human Osteoblast-Like Cells In Wtro. Electromagnetobiology. 15, 75-83 (2009).
- Martino, C. F., Perea, H., Hopfner, U., Ferguson, V. L., Wintermantel, E. Effects of weak static magnetic fields on endothelial cells. Bioelectromagnetics. 31 (4), 296-301 (2010).
- Wada, K., et al. Design and implementation of multi-frequency magnetic field generator producing sinusoidal current waveform for biological researches. 2016 18th European Conference on Power Electronics and Applications (EPE’16 ECCE Europe). 2016, 1-8 (2016).
- Cho, H., Kim, S., Kim, K. K., Kim, K., Kim, K. Pulsed Electromagnetic Fields Stimulate Cellular Proliferation in Different Types of Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 52 (7), 1-4 (2016).
- Yan, J., Dong, L., Zhang, B., Qi, N. Effects of extremely low-frequency magnetic field on growth and differentiation of human mesenchymal stem cells. Electromagnetic Biology and Medicine. 29 (4), 165-176 (2010).
- Enoch, S., Grey, J. E., Harding, K. G. ABC of wound healing. Non-surgical and drug treatments. BMJ. 332 (7546), 900-903 (2006).
- Bhosale, A. M., Richardson, J. B. Articular cartilage: Structure, injuries and review of management. British Medical Bulletin. 87 (1), 77-95 (2008).
- Al Hamed, R., Bazarbachi, A. H., Malard, F., Harousseau, J. -. L., Mohty, M. Current status of autologous stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood Cancer Journal. 9 (4), 44 (2019).
- Massari, L., et al. Biophysical stimulation of bone and cartilage: state of the art and future perspectives. International Orthopaedics. 43 (3), 539-551 (2019).
- Naskar, S., Kumaran, V., Basu, B. Reprogramming the Stem Cell Behavior by Shear Stress and Electric Field Stimulation: Lab-on-a-Chip Based Biomicrofluidics in Regenerative Medicine. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 5 (2), 99-127 (2019).
- Hunckler, J., de Mel, A. A current affair: electrotherapy in wound healing. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 10, 179-194 (2017).
- Henry, S. L., Concannon, M. J., Yee, G. J. The effect of magnetic fields on wound healing: experimental study and review of the literature. Eplasty. 8, 393-399 (2008).
- Hiemer, B., et al. Effect of electric stimulation on human chondrocytes and mesenchymal stem cells under normoxia and hypoxia. Molecular Medicine Reports. 18 (2), 2133-2141 (2018).
- Chao, P. H., et al. Chondrocyte translocation response to direct current electric fields. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (3), 261-267 (2000).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J., McCaig, C. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117 (3), 397-405 (2004).
- Li, X., Kolega, J. Effects of direct current electric fields on cell migration and actin filament distribution in bovine vascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 39 (5), 391-404 (2002).
- Singh, B., Dixit, A. Multistage amplifier and tuned amplifier. Analog Electronics. , 87-131 (2007).
- Esfandiari, E., et al. The effect of high frequency electric field on enhancement of chondrogenesis in human adipose-derived stem cells. Iranian Journal Basic Medical Sciences. 4 (3), 571-576 (2014).
- Mardani, M., et al. Induction of chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by low frequency electric field. Advanced Biomedical Research. 5 (97), 1-7 (2016).
- Karaman, O., Gümüşay, M., Demirci, E. A., Kaya, A. Comparative assessment of pulsed electromagnetic fields (PEMF) and pulsed radio frequency energy (PRFE) on an in vitro wound healing model. International Journal of Applied Electromagnetics and Mechanics. 57, 427-437 (2018).
- Glinka, M., et al. Test chambers for cell culture in static magnetic field. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 331, 208-215 (2013).
- Vacek, T. P., et al. Electrical stimulation of cardiomyocytes activates mitochondrial matrix metalloproteinase causing electrical remodeling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 404 (3), 762-766 (2011).
- Okutsu, S., et al. Electric Pulse Stimulation Induces NMDA Glutamate Receptor mRNA in NIH3T3 Mouse Fibroblasts. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 181-187 (2008).
