Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu
Summary
Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Asetillenmiş histone proteinleri, bir mutant kodlayan Escherichia coli’de kolayca ifade edilebilir, Nε-asetil-lizin (AcK)-spesifik Methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ve onun konyak tRNA (tRNAPyl)siteye özgü asetillenmiş histonları ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek için. MmAcKRS1 ve tRNAPyl, Escherichia coli’deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA’daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sağlar. Bu teknik, H3 lizin sahalarında ACK’yı dahil etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Pyrrolysyl-tRNA sentezi (PylRS) ayrıca bölgeye özgü protein modifikasyonu veya fonksiyonelleştirme için diğer nonkanonik amino asitleri (ncAA’lar) içerecek şekilde kolayca geliştirilebilir. Burada MmAcKRS1 sistemini kullanarak AcK’yı histone H3’e dahil etmek ve asetillenmiş H3 proteinlerini yeniden inşa edilmiş mononükleozomlara entegre etmek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Asetillenmiş yeniden inşa edilmiş mononükleozomlar biyokimyasal ve bağlayıcı tahlillerde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilir. Modifiye mononükleozomların elde edilmesi, yeni etkileşimler keşfetmek ve epigenetiği anlamakla ilgili deneyler tasarlamak için çok önemlidir.
Introduction
Biz sentezlemek ve siteye özgü asetillelenmiş histonlar ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek içinPylRS ve tRNA Pyl kullandık. PylRS, post translational modifikasyonlara (PTM) sahip proteinler üretmek için genetik kod genişletme aracı olarak paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır ve genetik olarak yaklaşık 200 farklı nTA’yı içerecek şekilde evrimleştirilmiştir. PylRS, çeviri sırasında diğer amino asitlerden kaynaklanan rekabeti ortadan kaldırarak kehribar stop kodonuna dahil olur. PylRS ilk olarak metanojenik arkealarda keşfedilmiştir ve o zamandan beri kimyasal biyolojide yeni reaktif kimyasal grupları proteinlere dahil etmek için1,2.
MmAcKRS1, Methanosarcina mazei PylRS’den evrimleşmiştir ve laboratuvarımızda asetillenmiş proteinlerin sentezi için sıklıkla3, 4,5,6. MmAcKRS1, Escherichia coli’deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA’daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sunar. Bu teknik daha önce K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 ve K79 histone H3 lizin sitelerinde Sirtuin 1, 2, 6 ve 7’nin asetilasyonlu mononükleozomlar4,5,6üzerindeki aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Burada asetillenmiş histonları ifade etmek ve asetillenmiş nükleozomları yeniden inşa etmek için bu yöntemi detaylandırıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir deney sırasında bu protokolü her ayrıntıya uymak önemlidir. Nükleozomlar çok kararlı değildir ve bu protokolün belirlenmesinde çok fazla deneme yanılma olmuştur. Partiküller montaj işlemlerine kolayca müdahale edebileceğinden, her adımda (veya gözlendiği zaman) çökeltileri kaldırmak anahtardır. Her zaman ton örneklerini buzda tut. Nükleozomlar 4 °C’de çok uzun süre saklanırsa, kendiliğinden sökülebilirsiniz. Herhangi bir denemede kullanılmadan önce 2 haftadan uzun bir süre 4 °C’d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Wesley Wang’a bu protokole ve değerli akıl hocalığına zemin hazırlayıp verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GrantS R01GM127575 ve R01GM121584) ve Welch Foundation (Grant A-1715) tarafından desteklendi.
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2′,5′)pA(3′,5′)p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
