هنا نقدم طريقة للتعبير عن بروتينات الهستون الأسيتية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية وتجميع النيوكليوسومات المعاد تشكيلها في المختبر.
يمكن التعبير بسهولة عن بروتينات الهستون الأسيتية في الإشريكية القولونية ترميز متحولة، Nε-أسيتيل ليسين (AcK) محددة ميتانوساركينا مازي بيروليسين tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ورنا cognate (tRNAPyl)لتجميع الرتابات المعاد تشكيلها مع الهستونات المحددة الموقع. MmAcKRS1 و TRNAPyl تسليم ACK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدمج AcK في مواقع ال ليسين H3. يمكن أيضا أن تتطور بسهولة بيروليسيل-TRNA synthetase (PylRS) لدمج الأحماض الأمينية غير الكانانية الأخرى (ncAAs) لتعديل البروتين محددة الموقع أو وظيفية. هنا نحن بالتفصيل طريقة لدمج AcK باستخدام نظام MmAcKRS1 في H3 الهستون ودمج البروتينات H3 أسيتيلاتيد في mononucleosomes المعاد تشكيلها. يمكن استخدام أحاديات النوكليوسومات المعاد تشكيلها في المقايسات الكيميائية الحيوية والملزمة ، وتحديد الهيكل ، وأكثر من ذلك. يعد الحصول على النويدات أحادية النواة المعدلة أمرا حاسما لتصميم التجارب المتعلقة باكتشاف تفاعلات جديدة وفهم علم الوراثة اللاجينية.
لقد استخدمنا PylRS و TRNAPyl لتجميع وتجميع mononucleosomes المعاد تشكيلها مع الهستونات الأسيتيlated الموقع محددة. وقد ثبت PylRS لا تقدر بثمن كأداة لتوسيع الشفرة الوراثية لإنتاج البروتينات مع تعديلات ما بعد التحويل (PTMs) وتطورت وراثيا لدمج حوالي 200 ncAAs مختلفة. PylRS يدمج في وقف الكهرمان codon، وإزالة المنافسة من الأحماض الأمينية الأخرى أثناء الترجمة. تم اكتشاف PylRS لأول مرة في archaea الميثانوجينية ، ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في البيولوجيا الكيميائية لدمج مجموعات كيميائية تفاعلية جديدة في البروتينات1،2.
تم تطوير MmAcKRS1 من ميتانوساركينا مازي PylRS وكثيرا ما تستخدم في مختبرنا لتركيب البروتينات الأسيتيلاتيد3،4،5،6. MmAcKRS1 يسلم AcK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدمج ACK في K4، K9، K14، K18، K23، K27، K36، K56، K64، و K79 هيستون H3 مواقع ليسين لدراسة نشاط سيرتوين 1، 2، 6، و 7 على mononucleosomes أسيتيلاتيد4،5،6. هنا نحن بالتفصيل هذه الطريقة للتعبير عن الهستونات أسيتيلاتيد وإعادة تشكيل النيوكليوسومات الأسيتيlated.
من الضروري اتباع هذا البروتوكول بكل التفاصيل أثناء التجربة. النوى ليست مستقرة جدا والكثير من التجربة والخطأ قد ذهب إلى تحديد هذا البروتوكول. من المهم إزالة الرواسب في كل خطوة (أو كلما لوحظ) لأن الجسيمات يمكن أن تتداخل بسهولة مع عمليات التجميع. دائما احتفظ بعينات الهستون على الثلج إذا تم تخ?…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر الدكتور ويسلي وانغ على إرساء الأساس لهذا البروتوكول وإرشاده القيم. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح R01GM127575 وR01GM121584) ومؤسسة ويلش (منحة A-1715).
0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
100x TE Buffer | NA | NA | |
2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
Acetyllysine | |||
Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
Elution Buffer | NA | NA | |
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
His-TEV protease | |||
Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
petDUET-His-TEV-H2A | |||
petDUET-His-TEV-H2B | |||
petDUET-His-TEV-H3 | |||
pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
Thermocycler |