Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli
Summary
Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.
Abstract
Proteínas histonas acetiladas podem ser facilmente expressas em Escherichia coli codificando um mutante, Nε-acetil-lysine (AcK)-específica Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) e seu tRNA cognato (tRNAPyl) para reunir mononucleosmos estabelecidos com histones acetiladas específicas. MmAcKRS1 e tRNAPyl entregam AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica tem sido usada extensivamente para incorporar AcK em locais de lise H3. A sithetase pirrolysíl-tRNA (PylRS) também pode ser facilmente evoluída para incorporar outros aminoácidos não-orônicos (ncAAs) para modificação ou funcionalização de proteínas específicas do local. Aqui detalhamos um método para incorporar o AcK usando o sistema MmAcKRS1 no histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas em mononucleosmos reconstituídos. Mononucleososes reconstituídos acetilados podem ser usados em ensaios bioquímicos e de ligação, determinação da estrutura e muito mais. A obtenção de mononucleosmos modificados é crucial para projetar experimentos relacionados à descoberta de novas interações e compreensão da epigenética.
Introduction
Utilizamos PylRS e tRNAPyl para sintetizar e montar mononucleosmos reconstituídos com histones acetilados específicos do local. A PylRS provou ser inestimável como uma ferramenta de expansão de código genético para produzir proteínas com modificações pós-translacionais (PTMs) e foi geneticamente evoluída para incorporar cerca de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora em um códon de parada âmbar, removendo a concorrência de outros aminoácidos durante a tradução. PylRS foi descoberto pela primeira vez na arquiaia metogênica, e desde então tem sido utilizado em biologia química para incorporar novos grupos químicos reativos em proteínas1,2.
O MMAcKRS1 foi evoluído de Metanoosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizado em nosso laboratório para a síntese de proteínas acetiladas3,4,5,6. MmAcKRS1 fornece AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica foi usada anteriormente para incorporar ack em k4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, e K79 histone H3 lysine sites para estudar a atividade de Sirtuin 1, 2, 6, e 7 em mononucleosmos acetilados4,5,6. Aqui detalhamos este método para expressar histones acetilados e nucleosómos acetilados reconstituídos.
Protocol
Representative Results
Discussion
É essencial seguir este protocolo em cada detalhe durante um experimento. Os nucleosmos não são muito estáveis e muita tentativa e erro foi para determinar este protocolo. É fundamental remover precipitados a cada passo (ou sempre observado) porque as partículas podem interferir facilmente nos processos de montagem. Sempre mantenha amostras de histona no gelo. Se os nucleosómos são armazenados a 4 °C por muito tempo, eles podem desmontar espontaneamente. Certifique-se de verificar quaisquer amostras por Native P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Wesley Wang por estabelecer as bases para este protocolo e sua valiosa mentoria. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e pela Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
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