تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

Summary

إن إشارات الكالسيوم الجهازية التي تسببها الغلوتامات خارج الخلية أمر بالغ الأهمية لتحريض استجابات الدفاع النباتي على الجرح الميكانيكي وهجوم الحيوانات العاشبة في النباتات. توضح هذه المقالة طريقة لتصور الديناميكيات المكانية والزمنية لكل من هذين العاملين باستخدام نباتات Arabidopsis thaliana التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية الحساسة للكالسيوم والغلوتامات.

Abstract

تستجيب النباتات للضغوط الميكانيكية مثل الجرح وآكلي الأعشاب من خلال تحفيز الاستجابات الدفاعية سواء في الأجزاء التالفة أو البعيدة. عند جرح ورقة، تحدث زيادة في تركيز أيونات الكالسيوم الخلوية (Ca²⁺ إشارة) في موقع الجرح. يتم إرسال هذه الإشارة بسرعة إلى الأوراق غير التالفة ، حيث يتم تنشيط الاستجابات الدفاعية. كشفت أبحاثنا الأخيرة أن الغلوتامات المتسربة من الخلايا المصابة من الورقة إلى الأبوبلاست من حولهم بمثابة إشارة جرح. هذا الغلوتامات ينشط مستقبلات الغلوتامات مثل قنوات Ca²⁺ نفاذية، مما يؤدي بعد ذلك إلى انتشار إشارة Ca²⁺ لمسافات طويلة في جميع أنحاء المصنع. ويمكن التقاط الخصائص المكانية والزمانية لهذه الأحداث من خلال التصوير في الوقت الحقيقي للنباتات الحية التي تعبر عن أجهزة الاستشعار البيولوجية الفلورية المشفرة وراثيا. هنا نقدم طريقة تصوير على مستوى النبات في الوقت الحقيقي لمراقبة ديناميكيات كل من إشارات Ca^{2 +} والتغيرات في الغلوتامات المبرمج التي تحدث استجابة للإصابة. يستخدم هذا النهج مجهر مضان واسع المجال ونباتات أربيدوبسي المعدلة وراثيا تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) القائم على Ca²⁺ و أجهزة الاستشعار الحيوية الغلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، نقدم منهجية للحصول بسهولة على انتشار إشارة Ca²⁺ الناجم عن الجروح والغلوتامات. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الدراسات المتعلقة بضغوط النباتات الأخرى للمساعدة في التحقيق في كيفية مشاركة الإشارات النظامية النباتية في شبكات الإشارات والاستجابة الخاصة بها.

Introduction

لا يمكن للنباتات الهروب من الضغوط الحيوية ، على سبيل المثال ، الحشرات التي تتغذى عليها ، لذلك فقد تطورت أنظمة متطورة لاستشعار الإجهاد ونقل الإشارات للكشف عن ثم حماية نفسها من تحديات مثل عشبي¹. عند الجرح أو هجوم عشبي ، تبدأ النباتات استجابات دفاعية سريعة بما في ذلك تراكم حمض الجاسموني النباتي (JA) ليس فقط في موقع الجرحى ولكن أيضا في الأعضاء البعيدة غير التالفة². هذا JA ثم يؤدي كل من الاستجابات الدفاعية في الأنسجة التالفة مباشرة ويحفز بشكل استباقي الدفاعات في الأجزاء غير التالفة من المصنع. في Arabidopsis، تم الكشف عن تراكم JA الناجم عن الجرح في أوراق بعيدة وسليمة في غضون دقائق قليلة من الضرر في مكان آخر في المصنع مما يشير إلى أن إشارة سريعة وطويلة المدى يتم إرسالها من ورقة الجرحى³. وقد اقترح العديد من المرشحين، مثل Ca^{2 +}، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، والإشارات الكهربائية، لتكون بمثابة هذه الإشارات الجرح لمسافات طويلة في النباتات^4،5.

Ca^{2 +} هي واحدة من العناصر رسول الثاني الأكثر تنوعا وفي كل مكان في الكائنات الحية eukaryotic. في النباتات، مضغ كاتربيلر والميكاميكالية تسبب زيادات كبيرة في تركيز Ca²⁺ الخلوية ([Ca²⁺]_cyt) سواء في ورقة الجرحى أو في أوراق بعيدة غير مذبذبة^6،7. يتم تلقي هذه الإشارة Ca^{2 +} الجهازية بواسطة بروتينات الاستشعار Ca^{2 +}داخل الخلية ، والتي تؤدي إلى تنشيط مسارات إشارات الدفاع المصب ، بما في ذلك التمثيل الحيوي JA^8،9. على الرغم من العديد من هذه التقارير التي تدعم أهمية إشارات Ca^{2 +} في استجابات جرح النبات ، فإن المعلومات حول الخصائص المكانية والزمنية لإشارات Ca^{2 +} الناجمة عن الإصابة محدودة.

التصوير في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات Ca²⁺ المشفرة وراثيا هو أداة قوية لرصد وقياس الديناميكيات المكانية والزمنية لإشارات Ca²⁺ . حتى الآن، وقد وضعت إصدارات من أجهزة الاستشعار من هذا القبيل التي تمكن التصور من إشارات Ca^{2 +} على مستوى خلية واحدة، إلى الأنسجة والأعضاء وحتى النباتات كلها¹⁰. وكان أول جهاز استشعار حيوي مشفرة وراثيا لCa^{2 +} المستخدمة في النباتات aequorin البروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا¹¹. على الرغم من أن هذا البروتين chemiluminescent قد استخدمت للكشف عن Ca^{2 +} التغييرات استجابة لضغوط مختلفة في النباتات^{12،13،14،15،16،17،18}، فإنه ليس مناسبا تماما للتصوير في الوقت الحقيقي بسبب إشارة الإنارة منخفضة للغاية التي تنتجها. Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) المستندة إلى Ca^{2 +} المؤشرات، مثل cameleons الأصفر، كما استخدمت بنجاح للتحقيق في ديناميات مجموعة من Ca²⁺ إشارات الأحداث في محطات^{19،20،21،22،23،24}. تتوافق أجهزة الاستشعار هذه مع نهج التصوير وتتكون الأكثر شيوعا من كالمودولين بروتين Ca^{2 +} الملزم (CaM) والببتيد الملزم ل CaM (M13) من سلسلة كيناز ضوء الميوسين ، وكلها تنصهر بين اثنين من بروتينات الفلوروفور ، وعموما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) ومتغير البروتين الفلوري الأصفر (YFP)^10. Ca^{2 +} ملزمة لCAM يعزز التفاعل بين CaM و M13 مما يؤدي إلى تغيير تشكيلي للمستشعر. ويعزز هذا التغيير نقل الطاقة بين CFP وYFP، مما يزيد من كثافة الفلورسينس في YFP مع تقليل انبعاثات الفلورسينس من CFP. رصد هذا التحول من CFP إلى فلورية YFP ثم يوفر مقياسا للزيادة في مستوى Ca^{2 +} . بالإضافة إلى أجهزة الاستشعار FRET هذه، فإن أجهزة الاستشعار الحيوية Ca²⁺ المستندة إلى البروتين الفلوري الواحد (FP)، مثل GCaMP و R-GECO، تتوافق أيضا مع نهج التصوير النباتي وتستخدم على نطاق واسع لدراسة [Ca²⁺] تغييرات_السيت بسبب حساسيتها العالية وسهولة استخدامها^{25و26و27و28و29و30}. تحتوي GCaMPs على GFP واحد معتبدل بشكل دائري (cp) ، ومرة أخرى تنصهر في CaM والببتيد M13. يؤدي التفاعل المعتمد على Ca²⁺بين CaM و M13 إلى تغيير تشكيلي في المستشعر يعزز التحول في حالة البروتونات في cpGFP ، مما يعزز إشارة الفلورسنت. وهكذا، مع ارتفاع مستويات Ca²⁺ ، تزداد إشارة cpGFP.

للتحقيق في ديناميات إشارات Ca^{2 +} المتولدة استجابة للجرح الميكانيكي أو التغذية آكلة الأعشاب ، استخدمنا نباتات أرابيدوسيس ثاليانا المعدلة وراثيا التي تعبر عن متغير GCaMP ، GCaMP3 ، ومجهر مضان واسع المجال⁶. وقد نجح هذا النهج في تصور انتقال سريع لإشارة Ca^{2 +} لمسافات طويلة من موقع الجرح على ورقة إلى النبات بأكمله. وهكذا، تم الكشف عن زيادة في [Ca²⁺]_cyt على الفور في موقع الجرح ولكن تم نشر هذه الإشارة Ca²⁺ بعد ذلك إلى الأوراق المجاورة من خلال الأوعية الدموية في غضون بضع دقائق من الجرح. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن انتقال هذه الإشارة الجرح الجهازية السريعة يتم إلغاؤها في النباتات Arabidopsis مع الطفرات في اثنين من الجينات مثل مستقبلات الغلوتامات، ومستقبلات الغلوتامات مثل (GLR)، GLR3.3، وGLR3.6⁶. وGLRs يبدو أن تعمل كأحماض أمينية مسور Ca^{2 +} قنوات المشاركة في العمليات الفسيولوجية المتنوعة, بما في ذلك استجابة الجرح³, نمو أنبوب حبوب اللقاح³¹, تطوير الجذر³², استجابة الباردة³³, والمناعة الفطرية³⁴. على الرغم من هذه الوظيفة الفسيولوجية الواسعة المفهومة جيدا ل GLRs ، فإن المعلومات حول خصائصها الوظيفية ، مثل خصوصية الليغند ، والانتقائية الأيونية ، والتوطين دون الخلوي ، محدودة^35. ومع ذلك، ذكرت الدراسات الحديثة أن GLR3.3 و GLR3.6 مترجمة في phloem وxylem، على التوالي. GLRs النباتية لها أوجه تشابه مع مستقبلات الغلوتامات الأيونية (iGluRs)³⁶ في الثدييات ، والتي يتم تنشيطها عن طريق الأحماض الأمينية ، مثل الغلوتامات والجليسين وD-سيرين في الجهاز العصبي للثدييات³⁷. في الواقع، أثبتنا أن تطبيق الغلوتامات 100 mM، ولكن ليس غيرها من الأحماض الأمينية، في موقع الجرح يحفز سريعة، لمسافات طويلة Ca^{2+ إشارة} في Arabidopsis،مما يشير إلى أن الغلوتامات خارج الخلية من المرجح أن يكون بمثابة إشارة الجرح في النباتات⁶. يتم إلغاء هذا الرد في glr3.3/glr3.6 متحولة مما يوحي بأن الغلوتامات قد يكون يتصرف من خلال واحدة أو كل من هذه القنوات مثل مستقبلات وبالفعل, AtGLR3.6 وقد تبين مؤخرا أن بوابات من قبل هذه المستويات من الغلوتامات³⁸.

في النباتات، بالإضافة إلى دورها كحامض أميني هيكلي، كما اقترح الغلوتامات كمنظم التنمية الرئيسية^39؛ ومع ذلك، فإن دينامياتها المكانية والزمنية غير مفهومة بشكل جيد. تماما كما لCa^{2 +}, وقد وضعت العديد من المؤشرات المشفرة وراثيا للغلوتامات لرصد ديناميات هذه الأحماض الأمينية في الخلايا^{الحية 40,41}. iGluSnFR هو GFP القائم على واحد FP الجلوتامات الاستشعار الحيوي تتألف من cpGFP وبروتين ملزم الغلوتامات (GltI) من الإشريكية القولونية^42،43. التغيير التوافقي ل iGluSnFR ، الذي يسببه ربط الغلوتامات ب GltI ، يؤدي إلى انبعاث فلوري GFP معزز. للتحقيق في ما إذا كان الغلوتامات خارج الخلية بمثابة جزيء إشارة في استجابة جرح النبات ، قمنا بتوصيل تسلسل iGluSnFR مع تسلسل إفراز الببتيد الأساسي للإشارة الشيتاتينية (CHIB-iGluSnFR) لتعريب هذا الاستشعار الحيوي في الفضاء المبرمج⁶. مكن هذا النهج التصوير من أي تغييرات في تركيز الغلوتامات المبرمج ([غلو]_آبو) باستخدام النباتات أربيدوبسيس المعدلة وراثيا التعبير عن هذا الاستشعار. اكتشفنا زيادات سريعة في إشارة iGluSnFR في موقع الجرح. هذه البيانات تدعم فكرة أن تسرب الغلوتامات من الخلايا التالفة / الأنسجة إلى أبوبلاست عند الجرح ويعمل كإشارة ضرر تفعيل GLRs ويؤدي إلى إشارة Ca^{2 +} لمسافات طويلة في النباتات⁶.

هنا، ونحن نصف طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لرصد وتحليل ديناميات إشارات Ca^{2 +} بعيدة المدى والجلوتامات خارج الخلية ردا على الجرح⁶. يوفر توافر المجهر الفلوري واسع المجال والنباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا نهجا قويا ، ولكن يسهل تنفيذه للكشف عن الإشارات البعيدة المدى التي تنتقل بسرعة ، مثل موجات Ca^{2 +} .

Protocol

1. إعداد المواد النباتية في 1.5 مل ميكروبتوب، سطح تعقيم بذور أربيدوبسيس تاليانا (كول-0 الانضمام) مصنع التعبير عن إما GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR عن طريق هز مع 20٪ (v/v) NaClO لمدة 3 دقائق ثم يغسل 5 مرات مع الماء المقطر العقيم.ملاحظة: خطوط المعدلة وراثيا من Arabidopsis التعبير عن GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR وقد وصفت س…

Representative Results

يتم عرض نشر إشارة [Ca2 +]cyt و [Glu] apo ردا على الجرح في الشكل 3، الشكل 4، فيلم S1، والفيلم S2. قطع petiole من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (في 0 ق) أدى إلى زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt التي تم حثها بسرعة محليا م?…

Discussion

الإشارات النظامية مهمة للنباتات للاستجابة للمحفزات البيئية الخارجية المحلية ومن ثم الحفاظ على التوازن على مستوى النبات بأكمله. على الرغم من أنها ليست مجهزة جهاز عصبي متقدم مثل الحيوانات، فإنها تستخدم الاتصالات السريعة داخل وبين الأجهزة على حد سواء على أساس عوامل مثل الكهربائية المتنقل?…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16