Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Summary

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l’induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all’attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Abstract

Gli impianti rispondono a sollecitazioni meccaniche come ferite ed erbivori inducendo risposte di difesa sia nelle parti danneggiate che in quelle non danneggiate. Al momento del mento di una foglia, si verifica un aumento della concentrazione citosolica di ioni di calcio (segnale Ca^{2 +)} nel sito della ferita. Questo segnale viene rapidamente trasmesso a foglie non danneggiate, dove vengono attivate le risposte della difesa. La nostra recente ricerca ha rivelato che il glutammato che fuorie’ dalle cellule ferite della foglia nell’apoplasto che li circonda serve come segnale di ferita. Questo glutammato attiva canali permeabili Ca²⁺ simili al recettore del glutammato, che quindi porta alla propagazione del segnale Ca²⁺ a lunga distanza in tutta la pianta. Le caratteristiche spaziali e temporali di questi eventi possono essere catturate con l’imaging in tempo reale di piante viventi che esprimono biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Qui introduciamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale per monitorare la dinamica dei segnali Ca^{2 +} e i cambiamenti nel glutammato apoplastico che si verificano in risposta al mento. Questo approccio utilizza un microscopio a fluorescenza a campo ampio e piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono biosensori Ca²⁺ a base di proteina fluorescente verde (GFP) e biosensori glutammati. Inoltre, presentiamo una metodologia per suscitare facilmente la propagazione del segnale Ca²⁺ indotta da ferite, innescata dal glutammato e rapida e a lunga distanza. Questo protocollo può anche essere applicato a studi su altre sollecitazioni dell’impianto per aiutare a studiare come la segnalazione sistemica degli impianti potrebbe essere coinvolta nelle loro reti di segnalazione e risposta.

Introduction

Le piante non possono sfuggire agli stress biotici, ad esempio gli insetti che si nutrono di loro, quindi hanno sviluppato sofisticati sistemi di rilevamento dello stress e trasduzione del segnale per rilevare e quindi proteggersi da sfide come l’erbivoro¹. Al momento del mento o dell’attacco di erbivoro, le piante avviano risposte rapide di difesa tra cui l’accumulo dell’acido jasmonico fitoormone (JA) non solo nel sito ferito ma anche negli organi distale non danneggiati². Questo JA quindi innesca risposte di difesa nei tessuti direttamente danneggiati e induce preemptive difese nelle parti non danneggiate della pianta. In Arabidopsis, l’accumulo di JA indotto dal mento è stato rilevato in foglie distale e intatte entro pochi minuti dai danni altrove nella pianta suggerendo che un segnale rapido e a lunga distanza viene trasmesso dalla foglia^{ferita 3}. Diversi candidati, come Ca^2+,specie reattive dell’ossigeno (ROS) e segnali elettrici, sono stati proposti per servire come questi segnali di ferita a lunga distanza nelle^{piante 4,5}.

Ca²⁺ è uno dei secondi elementi messaggeri più versatili e onnipresenti negli organismi eucarioti. Nelle piante, la masticazione del bruco e il mento meccanico causano drastici aumenti della concentrazione citosolica di Ca^{2 +} ([Ca²⁺]_cyt) sia nella foglia ferita che nelle foglie lontane non liche^6,7. Questo segnale ca^{2+ sistemico} viene ricevuto dalle proteine intracellulari ca^2+,che portano all’attivazione di vie di segnalazione della difesa a valle, tra cui biosintesi JA^8,9. Nonostante numerosi rapporti di questo tipo supportano l’importanza dei segnali Ca²⁺ nelle risposte delle ferite delle piante, le informazioni sulle caratteristiche spaziali e temporali dei segnali Ca²⁺ indotti dal ferimento sono limitate.

L’imaging in tempo reale utilizzando indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati è un potente strumento per monitorare e quantificare la dinamica spaziale e temporale dei segnali Ca^2+. Ad oggi, sono state sviluppate versioni di tali sensori che consentono la visualizzazione di segnali Ca^{2 +} a livello di una singola cellula, a tessuti, organi e persino piante intere¹⁰. Il primo biosensore geneticamente codificato per Ca²⁺ utilizzato nelle piante è stata l’aequorina proteica bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea victoria¹¹. Sebbene questa proteina chemiluminescente sia stata utilizzata per rilevare cambiamenti Ca²⁺ in risposta a varie sollecitazioni nelle piante^{12,13,14,15,16,17,18}, non è adatta per l’imaging in tempo reale a causa del segnale luminescente estremamente basso che produce. Gli indicatori Ca²⁺ basati su Förster Resonance Energy Transfer (FRET), come i camelioni gialli, sono stati utilizzati con successo anche per indagare la dinamica di una serie di eventi^{di segnalazione} Ca 2 + negli^{impianti 19,20,21,22,23,24}. Questi sensori sono compatibili con gli approcci di imaging e più comunemente sono composti dalla calmodulina proteica legante Ca²⁺ (CaM) e da un peptide legante CaM (M13) da una chinasi della catena leggera della miosina, tutti fusi tra due proteine fluorofori, generalmente una proteina fluorescente ciano (CFP) e una variante della proteina fluorescente gialla (YFP)¹⁰. L’associazione Ca²⁺ a CaM favorisce l’interazione tra CaM e M13 portando a un cambiamento conformazionale del sensore. Questo cambiamento promuove il trasferimento di energia tra la PCP e l’YFP, il che aumenta l’intensità di fluorescenza dell’YFP riducendo al contempo le emissioni di fluorescenza della PCP. Il monitoraggio di questo passaggio dalla PCP alla fluorescenza YFP fornisce quindi una misura dell’aumento del livello Ca^2+. Oltre a questi sensori FRET, i biosensori Ca²⁺ a base di proteine fluorescenti singole (FP), come GCaMP e R-GECO, sono anche compatibili con gli approcci di imaging vegetale e sono ampiamente utilizzati per studiare [Ca²⁺]_{cambiamenti del cito} a causa della loro elevata sensibilità e facilità d’uso^{25,26,27,28,29,30}. I GCAMP contengono un singolo GFP permutato circolare (cp), nuovamente fuso a CaM e al peptide M13. L’interazione dipendente da Ca²⁺tra CaM e M13 provoca un cambiamento conformazionale nel sensore che promuove uno spostamento dello stato di protonazione del cpGFP, migliorando il suo segnale fluorescente. Pertanto, con^{l’aumento dei livelli di} Ca 2+, il segnale cpGFP aumenta.

Per indagare la dinamica dei segnali Ca²⁺ generati in risposta a ferite meccaniche o alimentazione di erbivori, abbiamo utilizzato piante transgeniche arabidopsis thaliana che esprimono una variante GCaMP, GCaMP3, e un microscopio a fluorescenza a campo^{largo 6}. Questo approccio è riuscito a visualizzare la trasmissione rapida di un segnale Ca²⁺ a lunga distanza dal sito della ferita su una foglia a tutta la pianta. Pertanto, un aumento del cito [Ca²⁺]_è stato immediatamente rilevato nel sito della ferita, ma questo segnale Ca^{2 +} è stato poi propagato alle foglie vicine attraverso la vascucolatura entro pochi minuti dal mento. Inoltre, abbiamo scoperto che la trasmissione di questo rapido segnale di ferita sistemica è abolita nelle piante arabidopsis con mutazioni in due geni simili al recettore del glutammato, Glutammato Recettore Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.6⁶. I GLR sembrano funzionare come canali Ca²⁺ recintati da amminoacidi coinvolti in diversi processi fisiologici, tra cui risposta^{alle ferite 3,}crescita del tubo di polline^31,sviluppo delle radici^32,risposta al^{freddo 33}e immunità innata³⁴. Nonostante questa ben compresa, ampia funzione fisiologica dei GLR, le informazioni sulle loro proprietà funzionali, come la loro specificità ligando, la selettività ioniche e la localizzazione subcellulare, sono^{limitate 35}. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che GLR3.3 e GLR3.6 sono localizzati rispettivamente nel phloem e nello xilema. I GLR vegetali hanno somiglianze con i recettori del glutammato ionotropico (iGluRs)³⁶ nei mammiferi, che vengono attivati dagli amminoacidi, come glutammato, glicina e D-serina nel sistema nervoso dei mammiferi³⁷. Infatti, abbiamo dimostrato che l’applicazione di glutammato di 100 mM, ma non di altri amminoacidi, nel sito della ferita induce un segnale Ca^{2 +} rapido e a lunga distanza in Arabidopsis, indicando che il glutammato extracellulare agisce probabilmente come un segnale di ferita nelle piante⁶. Questa risposta è abolita nel mutante glr3.3/glr3.6 suggerendo che il glutammato possa agire attraverso uno o entrambi questi canali simili a recettori e, in effetti, AtGLR3.6 è stato recentemente dimostrato essere gated da questi livelli di glutammato³⁸.

Nelle piante, oltre al suo ruolo di amminoacido strutturale, il glutammato è stato proposto anche come regolatore chiave dello sviluppo^39; tuttavia, le sue dinamiche spaziali e temporali sono poco comprese. Proprio come per Ca^2+,sono stati sviluppati diversi indicatori geneticamente codificati per il glutammato per monitorare la dinamica di questo amminoacido nelle cellule^{viventi 40,41}. iGluSnFR è un biosensore glutammato single-FP basato su GFP composto da cpGFP e una proteina legante il glutammato (GltI) di Escherichia coli^42,43. Il cambiamento conformazionale di iGluSnFR, indotto dal legame del glutammato con GltI, si traduce in una maggiore emissione di fluorescenza GFP. Per indagare se il glutammato extracellulare agisce come una molecola di segnalazione nella risposta della ferita vegetale, abbiamo collegato la sequenza iGluSnFR con la sequenza di secrezione peptidica del segnale chitinasio di base (CHIB-iGluSnFR) per localizzare questo biosensore nello spazio apoplastico⁶. Questo approccio ha permesso di imaging di eventuali cambiamenti nella concentrazione di glutammato apoplastico ([Glu]_apo) utilizzando piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono questo sensore. Abbiamo rilevato rapidi aumenti del segnale iGluSnFR nel sito di wounding. Questi dati supportano l’idea che il glutammato fuoriesi dalle cellule / tessuti danneggiati all’apoplasto al momento del mento e agisce come un segnale di danno attivando i GLR e portando al segnale Ca^{2 +} a lunga distanza nelle piante⁶.

Qui, descriviamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale utilizzando biosensori geneticamente codificati per monitorare e analizzare la dinamica dei segnali ca²⁺ a lunga distanza e glutammato extracellulare in risposta al^{mento 6}. La disponibilità di microscopia a fluorescenza a campo largo e piante transgeniche che esprimono biosensori geneticamente codificati fornisce un approccio potente ma facilmente implementato per rilevare segnali a lunga distanza trasmessi rapidamente, come le onde Ca^2+.

Protocol

1. Preparazione del materiale vegetale In un microtubo da 1,5 mL, sterilizzare in superficie i semi della pianta arabidopsis thaliana (adesione Col-0) esprimendo GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR tremando con il 20% (v/v) NaClO per 3 minuti e quindi lavare 5 volte con acqua distillata sterile.NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR sono state descritte in precedenza6. In un cappuccio sterile, seminare 13 semi sterilizzati in su…

Representative Results

La propagazione del segnale di [Ca2+]cyt e [Glu]apo in risposta al collare è presentata nella Figura 3, Figura 4, Filmato S1e Filmato S2. Il taglio del picciolo della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 (a 0 s) ha portato a un aumento significativo delcit [Ca2+] che è stato rapidamente indotto localmente attraverso la vascucolatura (…

Discussion

La segnalazione sistemica è importante per le piante per rispondere agli stimoli ambientali esterni localizzati e quindi per mantenere la loro omeostasi a un intero livello di impianto. Sebbene non siano dotati di un sistema nervoso avanzato come gli animali, impiegano una comunicazione rapida sia all’interno che tra gli organi sulla base di fattori come segnali elettrici mobili (ed eventualmente idraulici) e onde di propagazione di ROS e Ca^{2 +46,47}. …

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16