Wide-Field, Realtidsavbildning av lokala och systemiska sårsignaler i Arabidopsis

Summary

Extracellulära glutamat-utlöst systemisk kalcium signalering är avgörande för induktion av växt försvar svar på mekanisk sårning och växtätande attack i växter. Denna artikel beskriver en metod för att visualisera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos båda dessa faktorer med Arabidopsis thaliana växter som uttrycker kalcium- och glutamatkänsliga fluorescerande biosensorer.

Abstract

Växter reagerar på mekaniska påfrestningar som sår och växtätande genom att inducera försvarssvar både i de skadade och i de distala oskadade delarna. Vid sårning av ett blad sker en ökning av cytosolisk kalciumjonkoncentration (Ca^{2 +} signal) på sårplatsen. Denna signal överförs snabbt till oskadade löv, där försvarssvar aktiveras. Vår senaste forskning visade att glutamat som läcker från de sårade cellerna i bladet till apoplasten runt dem fungerar som en sårsignal. Detta glutamat aktiverar glutamatreceptorliknande Ca^{2 +} genomsläppliga kanaler, vilket sedan leder till långdistans Ca^{2 +} signalutbredning i hela växten. De rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos dessa händelser kan fångas med realtidsavbildning av levande växter som uttrycker genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Här introducerar vi en växtomfattande avbildningsmetod i realtid för att övervaka dynamiken hos både Ca²⁺ -signalerna och förändringar i apoplastiskt glutamat som uppstår som svar på sårning. Detta tillvägagångssätt använder ett brett fält fluorescensmikroskop och transgena Arabidopsis växter som uttrycker gröna fluorescerande protein (GFP) -baserade Ca^{2 +} och glutamat biosensorer. Dessutom presenterar vi metodik för att enkelt framkalla sårinducerad, glutamat-utlöst snabb och långdistans Ca^{2 +} signalutbredning. Detta protokoll kan också tillämpas på studier om andra växtspänningar för att hjälpa till att undersöka hur systemisk signalering av anläggningar kan vara involverade i deras signal- och svarsnätverk.

Introduction

Växter kan inte fly från biotiska påfrestningar, t.ex. insekter som matar på dem, så de har utvecklat sofistikerade stressavkänning och signaltransduktionssystem för att upptäcka och sedan skydda sig mot utmaningar som växtätande¹. Vid sår eller växtätare attack initierar växter snabba försvarssvar inklusive ackumulering av fytohormone jasmonic syra (JA) inte bara på den skadade platsen utan också i oskadade distala organ². Denna JA utlöser sedan båda försvarssvaren i de direkt skadade vävnaderna och inducerar förebyggande försvar i de oskadade delarna av växten. I Arabidopsisupptäcktes ackumuleringen av JA som inducerats genom sårning i distala, intakta löv inom bara några minuter efter skador någon annanstans i växten vilket tyder på att en snabb och långdistanssignal överförs från det sårade^{bladet 3}. Flera kandidater, såsom Ca²⁺, reaktiva syrearter (ROS) och elektriska signaler, har föreslagits att fungera som dessa långdistanssårsignaler i växter^4,5.

Ca²⁺ är ett av de mest mångsidiga och allestädes närvarande andra budbärarelementen i eukaryota organismer. I växter orsakar larvtuggning och mekanisk sårning drastiska ökningar av cytosolic Ca^{2 +} koncentrationen ([Ca^{2 +}]_cyt) både i det sårade bladet och i ovävda avlägsna blad^6,7. Denna systemiska Ca^{2 +} signal tas emot av intracellulära Ca^{2 +}-avkänningsproteiner, vilket leder till aktivering av nedströms försvarssignaleringsvägar, inklusive JA biosyntes^8,9. Trots många sådana rapporter som stöder vikten av Ca^{2 +} signaler i växt sår svar, information om rumsliga och tidsmässiga egenskaper hos Ca^{2 +} signaler framkallas genom sårning är begränsad.

Realtidsavbildning med genetiskt kodade Ca^{2+-indikatorer} är ett kraftfullt verktyg för att övervaka och kvantifiera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos Ca^2+-signaler. Hittills har versioner av sådana sensorer utvecklats som möjliggör visualisering av Ca^{2 + signaler} på nivån för en enda cell, till vävnader, organ och till och med hela växter¹⁰. Den första genetiskt kodade biosensorn för Ca^{2+ som} används i växter var det bioluminescerande proteinet aequorin som härrör från maneterna Aequorea victoria¹¹. Även om detta chemiluminescent protein har använts för att upptäcka Ca^{2 +} förändringar som svar på olika påfrestningar i^{växter 12,13,14,15,16,17,18}, det är inte väl lämpat för realtidsavbildning på grund av den extremt låga luminescent signalen den producerar. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserade Ca²⁺ indikatorer, såsom gula kamelonerna, har också framgångsrikt använts för att undersöka dynamiken i en rad Ca^{2 +} signaleringshändelser i växter^{19,20,21,22,23,24}. Dessa sensorer är kompatibla med bildframställningsmetoder och består oftast av Ca^{2 +} bindande proteinkalmodulin (CaM) och en CaM-bindande peptid (M13) från en myosin ljuskedjekinas, alla smälta mellan två fluorforproteiner, i allmänhet ett cyanfluorescerande protein (CFP) och en gul fluorescerande proteinvariant (YFP)¹⁰. Ca²⁺ bindning till CaM främjar interaktionen mellan CaM och M13 vilket leder till en konformationsförändring av sensorn. Denna förändring främjar energiöverföring mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP, vilket ökar YFP:s fluorescensintensitet samtidigt som fluorescensutsläppen från den gemensamma fiskeripolitiken minskar. Övervakningen av denna övergång från den gemensamma fiskeripolitiken till YFP-fluorescensen ger sedan ett mått på ökningen på Ca^2+-nivå. Förutom dessa FRET-sensorer är en fluorescerande protein (FP)-baserade Ca^{2 +} biosensorer, såsom GCaMP och R-GECO, också kompatibla med växtavbildningsmetoder och används ofta för att studera [Ca^{2 +}]_{cytförändringar} på grund av deras höga känslighet och användarvänlighet^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs innehåller en enda cirkulärt permuterad (cp) GFP, återigen smält till CaM och M13-peptiden. Den Ca²⁺beroende interaktionen mellan CaM och M13 orsakar en konformationell förändring i sensorn som främjar en förändring i protoneringstillståndet för cpGFP, vilket förbättrar dess fluorescerande signal. Således, när Ca^{2 + nivåer} stiger, ökar cpGFP-signalen.

För att undersöka^dynamiken hos Ca 2 + signaler som genereras som svar på mekanisk sårning eller växtätare utfodring, har vi använt transgena Arabidopsis thaliana växter som uttrycker en GCaMP variant, GCaMP3, och ett brett fält fluorescensmikroskop⁶. Detta tillvägagångssätt har lyckats visualisera snabb överföring av en långdistans Ca^{2 +} signal från sårplatsen på ett blad till hela växten. Således upptäcktes en ökning av [Ca^{2 +}]_cyt omedelbart på sårplatsen men denna Ca^{2 +} signal spreds sedan till de närliggande bladen genom vaskulaturen inom några minuter efter sådd. Dessutom fann vi att överföringen av denna snabba systemiska sårsignal avskaffas i Arabidopsis växter med mutationer i två glutamat receptor-liknande gener, glutamat receptorn som (GLR), GLR3.3 och GLR3.6⁶. GLR verkar fungera som aminosyra gated Ca^{2 + kanaler} involverade i olika fysiologiska processer, inklusive^{sårrespons 3,}pollenrör tillväxt^31,rotutveckling^32,kall^{respons 33}, och medfödd immunitet³⁴. Trots denna välförståeliga, breda fysiologiska funktion hos GLR, är information om deras funktionella egenskaper, såsom deras ligand specificitet, jon selektivitet och subcellulär lokalisering, begränsade³⁵. Nyligen genomförda studier rapporterade dock att GLR3.3 och GLR3.6 är lokaliserade i phloem respektive xylem. Växt GLR har likheter med jonotropa glutamatreceptorer (iGluR)³⁶ hos däggdjur, som aktiveras av aminosyror, såsom glutamat, glycin och D-serin i däggdjurens nervsystem³⁷. Vi visade faktiskt att tillämpningen av 100 mM glutamat, men inte andra aminosyror, på sårplatsen inducerar en snabb, långdistans Ca^{2 +} signal i Arabidopsis, vilket indikerar att extracellulär glutamat sannolikt fungerar som en sårsignal i växter⁶. Detta svar avskaffas i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på att glutamat kan agera genom en eller båda av dessa receptorliknande kanaler och faktiskt, AtGLR3.6 visade sig nyligen vara gated av dessa nivåer av glutamat³⁸.

I växter, förutom dess roll som en strukturell aminosyra, glutamat har också föreslagits som en viktig utvecklingsregulator^39; dess rumsliga och tidsmässiga dynamik är dock dåligt förstådd. Precis som för Ca^{2 +}har flera genetiskt kodade indikatorer för glutamat utvecklats för att övervaka dynamiken hos denna aminosyra i levande celler^40,41. iGluSnFR är en GFP-baserad glutamatbiosensor med en enda FP bestående av cpGFP och ett glutamatbindande protein (GltI) från Escherichia coli^42,43. Den konformationsmässiga förändringen av iGluSnFR, som induceras av glutamatbindning till GltI, resulterar i ett förbättrat GFP-fluorescensutsläpp. För att undersöka om extracellulär glutamat fungerar som en signalmolekyl i växtsårsrespons, kopplade vi iGluSnFR-sekvensen med den grundläggande chitinassignalpeptidutsöndringssekvensen (CHIB-iGluSnFR) för att lokalisera denna biosensor i det apoplastiska utrymmet⁶. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde avbildning av eventuella förändringar i den apoplastiska glutamatkoncentrationen ([Glu]_apo) med hjälp av transgena Arabidopsis-växter som uttrycker denna sensor. Vi upptäckte snabba ökningar i iGluSnFR signalen på sårplatsen. Dessa data stöder tanken att glutamat läcker ut ur de skadade cellerna /^vävnaderna till apoplasten vid sårning och fungerar som en skadesignal som aktiverar GLR och leder till långdistans Ca 2 + -signalen i växter⁶.

Här beskriver vi en växtomfattande realtidsavbildningsmetod med genetiskt kodade biosensorer för att övervaka och analysera^dynamiken hos långdistans Ca 2 + och extracellulära glutamatsignaler som svar på sår⁶. Tillgången till fluorescensmikroskopi och transgena växter som uttrycker genetiskt kodade biosensorer ger ett kraftfullt, men ändå lätt implementerat tillvägagångssätt för att upptäcka snabbt överförda långdistanssignaler, såsom Ca^{2 +} vågor.

Protocol

1. Förberedelse av växtmaterial I en 1,5 ml mikrotube steriliserar ytan fröna från Arabidopsis thaliana (Col-0 anslutning) växt som uttrycker antingen GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR genom att skaka med 20% (v/v) NaClO i 3 min och sedan tvätta 5 gånger med sterilt destillerat vatten.OBS: De transgena linjerna i Arabidopsis som uttrycker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har beskrivits tidigare6. I en steril huva sår du 13 ytsteriliserade frön på en 10 cm fyr…

Representative Results

Signalspridning av [Ca2+]cyt och [Glu]apo som svar på sårning presenteras i figur 3, figur 4, film S1och film S2. Styckning av bladbladets petiole 1 i växter som uttrycker GCaMP3 (vid 0 s) ledde till en betydande ökning av [Ca2 +]cyt som snabbt inducerades lokalt genom vaskulaturen (vid 40-talet) (Figur 3 och…

Discussion

Systemisk signalering är viktigt för växter att reagera på lokaliserade externa miljöstimulanser och sedan behålla sin homeostas på en hel anläggningsnivå. Även om de inte är utrustade med ett avancerat nervsystem som djur, använder de snabb kommunikation både inom och mellan organ baserat på faktorer som mobila elektriska (och eventuellt hydrauliska) signaler och förökningsvågor av ROS och Ca^{2 + 46,47}. Protokollet som beskrivs ovan t…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16