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Developmental Biology

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/62151
, , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics,Eotvos University

Summary

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。

Abstract

口蓋の発達は、舌の隣にある両側口蓋棚の垂直成長に続いて、舌の上に標高と融合を伴う動的なプロセスである。この過程の欠陥は、口蓋裂、共通の出生時欠損につながる。最近の研究では、口蓋棚の標高には、棚の向きを垂直から水平に変換する改造プロセスが含まれていることが示されています。この動的なリフォームにおける口蓋棚間葉細胞の役割は、研究が困難であった。タイムラプスイメージングベースの定量分析は、最近、一次マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞が集団運動に自己組織化できることを示すために使用されています。定量的解析では、口蓋の標高欠陥を持つマウス モデルから、変異 MEPM 細胞の違いを特定できます。本論文では、E13.5胚からMEPM細胞を分離して培養する方法について、特にタイムラプスイメージングのために、また、河川形成、形状アライメント、方向の持続性の測定を含む集団運動の様々な細胞属性を決定する方法について述べる。MEPM細胞は、標高の動的プロセス中に口蓋棚間葉系の役割を研究するためのプロキシモデルとして機能することができると考えています。これらの定量的方法により、頭蓋顔面場の研究者は、コントロール細胞と突然変異細胞の集団運動属性を評価および比較することができ、口蓋棚の上昇時の間葉リモデリングの理解を強化する。さらに、MEPM細胞は、一般的に集団細胞の動きを調べた稀な間葉細胞モデルを提供する。

Introduction

口蓋の発達は、口蓋形成の欠陥が口蓋裂につながり、単離した症例で起こる一般的な出生時欠損、または何百もの症候群1,2の一部として広範囲に研究されてきた。胚性口蓋の発達は、胚組織の移動および融合を伴う動的プロセスである。このプロセスは、口蓋棚の1)誘導、2)舌の隣の口蓋棚の垂直成長、舌の上の口蓋棚の3)上昇、および4)正中線1、3、4における口蓋棚の融合の4つの主要なステップに分けることができる。過去数十年にわたり、多くのマウス変異体が口蓋裂5、6、7、8を明らかに同定されてきた。これらのモデルの特徴は、口蓋棚誘導、増殖、および融合ステップにおける欠陥を示している。しかし、口蓋棚の標高欠陥はまれであった。したがって、口蓋棚の上昇のダイナミクスを理解することは、興味深い研究分野です。

口蓋棚の標高欠陥を有するいくつかのマウス変異体の慎重な分析は、口蓋棚の非常に前部領域が反転するように見えるが、口蓋棚の垂直から水平移動または「リモデリング」が口蓋1、3、4の後部領域に起こることを示す現在のモデルにつながっている。 9、10、11。口蓋棚の内側縁上皮は、この改造に必要なシグナリングを開始する可能性が高く、口蓋棚間葉によって駆動される。最近、多くの研究者は、口蓋棚12,13を含む一過性の経口接着を示すマウスモデルにおける口蓋棚の上昇遅延を同定した。間葉性のリモデリングは、細胞の再編成を伴い、水平方向に膨らみを作り出し、同時に口蓋棚を垂直方向9、10、14に引き込む。口蓋棚の上昇および基礎間葉リモデリングに影響を与えるために提案されたいくつかのメカニズムの中には、細胞増殖15、16、17、化学戦術勾配18、および細胞外マトリックス成分19、20がある。重要な疑問が生じた:Specc1l-欠損マウスで観察された口蓋棚の標高遅延も、口蓋棚の改造の欠陥も一因であり、この改修欠陥は、原発MEPM細胞21の挙動における本質的な欠陥に現れる可能性がありますか?

原発性MEPM細胞は、遺伝子発現22、23、24、25、26、27、28、29、および増殖を伴ういくつかの研究のために頭蓋顔面分野で使用されてきた30、31、32 を使用しますが、集合的な細胞行動分析には何もありません。MEPM細胞のタイムラプスイメージングを2D培養および創傷修復アッセイで行い、MEPM細胞が集団運動21の指向性運動および形成された密度依存性細胞ストリーム属性を示すことを示した。さらに、Specc1l変異細胞は、より狭い細胞ストリームを形成し、高可変細胞移動軌跡を示した。この協調運動性の欠如は、Specc1l変異胚13,21における口蓋上昇遅延に寄与すると考えられる。したがって、原発性MEPM細胞を用いたこれらの比較的単純なアッセイは、口蓋棚の上昇時に間葉リモデリングを研究するための代理として機能し得る。本論文では、2Dおよび創傷修復アッセイの経時経過イメージングと分析に加えて、一次MEPM細胞の単離と培養について述べている。

Protocol

動物を含むすべての実験は、ガイドラインと規制に従って、KUMC制度動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルで行われました(プロトコル番号:2018-2447)。 1. 収穫E13.5胚 CO2吸入室を使用するか、機関動物ケアと使用委員会によって承認された手順によって、妊娠中の雌マウスを安楽死させる。すぐに解剖に進みます。 皮膚と腹膜を取り?…

Representative Results

口蓋棚の解剖を図1に示す。切開のシーケンスは、組織の滑りを最小限に抑えるように設計されています.頭部の取り外し(図1A,B)に続いて、下顎が取り除かれる(図1B,C)。頭の上部の切開(図1C,D)は、逆さまに置くと組織を安定化させ(図1E)、ピンチ(…

Discussion

口蓋棚の標高は、垂直から水平方向のリモデリングイベント1、3、4、9、11を構成します。このリフォームプロセスでは、口蓋棚間葉細胞が協調的に振る舞う必要があると仮定されています。野生型 MEPM 細胞を用いた分析は、この細胞の挙動が組み込みであり、定量化で?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、国立衛生研究所の助成金DE026172(I.S.)とGM102801(A.C.)によって部分的に支援されました。I.S.はまた、生物医学研究優秀センター(COBRE)助成金(国立一般医学研究所P20 GM104936)、カンザスIDeA生物医学研究優秀基金(国立一般医学研究所P20 GM103418)、カンザス知的発達障害研究センター(KIDDRC)助成金(U54 Euniceケネディ・シュリバー、国立衛生研究所)の一部を支援されました。 HD090216)。

Materials

Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
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References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).

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Keywords: Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme CellsTime-lapse ImagingCollective Movement AttributesPalatal Shelf ElevationCraniofacial FieldMesenchymal RemodelingEmbryonic Day 13.5Palatal ShellMEPM Culture MediumFine ForcepsStainless Steel ScissorsCell Isolation
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Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).
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