Summary

Aislamiento e imágenes de lapso de tiempo de células mesenquimas palatinas embrionarias primarias de ratón para analizar los atributos del movimiento colectivo

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.

Abstract

El desarrollo del paladar es un proceso dinámico, que implica el crecimiento vertical de estantes palatales bilaterales junto a la lengua seguido de elevación y fusión por encima de la lengua. Los defectos en este proceso conducen al paladar hendido, un defecto congénito común. Estudios recientes han demostrado que la elevación de la plataforma palatal implica un proceso de remodelación que transforma la orientación de la plataforma de una vertical a una horizontal. El papel de las células mesenquimales de la plataforma palatal en esta remodelación dinámica ha sido difícil de estudiar. El análisis cuantitativo basado en imágenes de lapso de tiempo se ha utilizado recientemente para mostrar que las células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón (MEPM) pueden autoorganizarse en un movimiento colectivo. Los análisis cuantitativos pudieron identificar diferencias en las células MEPM mutantes a partir de un modelo de ratón con defectos de elevación del paladar. Este artículo describe métodos para aislar y cultivar células MEPM de embriones E13.5, específicamente para imágenes de lapso de tiempo, y para determinar varios atributos celulares del movimiento colectivo, incluidas las medidas para la formación de corrientes, la alineación de la forma y la persistencia de la dirección. Postula que las células MEPM pueden servir como un modelo proxy para estudiar el papel del mesénquima de la plataforma palatina durante el proceso dinámico de elevación. Estos métodos cuantitativos permitirán a los investigadores en el campo craneofacial evaluar y comparar los atributos de movimiento colectivo en células de control y mutantes, lo que aumentará la comprensión de la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Además, las células MEPM proporcionan un modelo de célula mesenquimal raro para la investigación del movimiento celular colectivo en general.

Introduction

El desarrollo del paladar se ha estudiado ampliamente ya que los defectos en la palatogénesis conducen al paladar hendido, un defecto congénito común que ocurre en casos aislados o como parte de cientos de síndromes1,2. El desarrollo del paladar embrionario es un proceso dinámico que implica el movimiento y la fusión del tejido embrionario. Este proceso se puede dividir en cuatro pasos principales: 1) inducción de estantes palatales, 2) crecimiento vertical de los estantes palatales junto a la lengua, 3) elevación de los estantes palatales por encima de la lengua, y 4) fusión de los estantes palatales en la línea media1,3,4. En las últimas décadas, se han identificado muchos mutantes de ratón que manifiestan paladar hendido5,6,7,8. La caracterización de estos modelos ha indicado defectos en los pasos de inducción, proliferación y fusión de la plataforma palatal; sin embargo, los defectos de elevación de la plataforma palatal han sido raros. Por lo tanto, comprender la dinámica de la elevación de la plataforma palatal es un área intrigante de investigación.

El análisis cuidadoso de algunos mutantes de ratón con defectos de elevación de la plataforma palatina ha llevado al modelo actual que muestra que la región muy anterior de la plataforma palatina parece voltearse hacia arriba, mientras que un movimiento vertical a horizontal o “remodelación” de las plataformas palatinas ocurre en las regiones medias a posteriores del paladar1,3,4, 9,10,11. El epitelio del borde medial de la plataforma palatal probablemente inicia la señalización requerida para esta remodelación, que luego es impulsada por el mesénquima de la plataforma palatina. Recientemente, muchos investigadores han identificado retraso en la elevación de la plataforma palatal en modelos de ratón que mostraron adherencias orales transitorias que involucran estantes palatales12,13. La remodelación mesenquimal implica la reorganización de las células para crear una protuberancia en la dirección horizontal, mientras que simultáneamente retrae el estante palatal en la dirección vertical9,10,14. Entre los diversos mecanismos propuestos para afectar la elevación de la plataforma palatina y la remodelación mesenquimal subyacente se encuentran la proliferación celular15,16,17,los gradientes quimiotácticos18y los componentes de la matriz extracelular19,20. Surgió una pregunta importante: ¿el retraso en la elevación de la plataforma palatal observado en ratones deficientes en Specc1ltambién se debe en parte a un defecto en la remodelación de la plataforma palatal, y podría este defecto de remodelación manifestarse en un defecto intrínseco en el comportamiento de las células PRIMARIAS de MEPM21?

Las células MEPM primarias se han utilizado en el campo craneofacial para muchos estudios que involucran la expresióngénica 22,23, 24,25,26,27,28,29,y algunos que involucran proliferación30,31 y migración25,31,32 , pero ninguno para el análisis colectivo del comportamiento celular. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células MEPM en cultivo 2D y ensayos de reparación de heridas para mostrar que las células MEPM mostraban movimiento direccional y formaban corrientes celulares dependientes de la densidad-atributos del movimiento colectivo21. Además, las células mutantes specc1l formaron flujos celulares más estrechos y mostraron trayectorias de migración celular muy variables. Se considera que esta falta de motilidad coordinada contribuye al retraso de la elevación del paladar en embriones mutantes Specc1l 13,21. Por lo tanto, estos ensayos relativamente simples que utilizan células MEPM primarias pueden servir como un proxy para estudiar la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de células MEPM primarias, así como las imágenes y análisis de lapso de tiempo, para los ensayos 2D y de reparación de heridas.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de KUMC, de acuerdo con sus directrices y regulaciones (Número de protocolo: 2018-2447). 1. Cosecha embriones E13.5 Sacrificar ratones hembra preñados utilizando una cámara de inhalación de CO2 o mediante un procedimiento aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Proceda inmediatamente a la disección….

Representative Results

La disección de los estantes palatales se ilustra en la Figura 1. La secuencia de incisiones está diseñada para minimizar el deslizamiento del tejido. Después de la extracción de la cabeza (Figura 1A,B), se retira la mandíbula inferior ( Figura1B, C). La incisión de la parte superior de la cabeza (Figura 1C,D) se realiza para estabilizar el tejid…

Discussion

La elevación de la plataforma palatal constituye un evento de remodelación vertical a horizontal1,3,4,9,11. Se postula que este proceso de remodelación requiere que las células mesenquimales de la plataforma palatal se comporten coordinadamente. Los análisis con células MEPM de tipo salvaje muestran que este comportamiento celular es intrínseco y puede …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue apoyado en parte por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DE026172 (I.S.) y GM102801 (A.C.). I.S. también fue apoyado en parte por la subvención del Centro de Excelencia en Investigación Biomédica (COBRE) (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM104936), la subvención de la Red IDeA de Kansas para la Excelencia en Investigación Biomédica (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20 GM103418) y la subvención del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo intelectual y del desarrollo (KIDDRC) de Kansas (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).

Play Video

Cite This Article
Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

View Video