Isolering och tidsfördröjning av primära mus embryonala palatala mesenchymeceller för att analysera kollektiva rörelseattribut
Summary
Vi presenterar ett protokoll för isolering och kultur av primära mus embryonala palatal mesenchymal celler för tid-förfall av avbildning av tvådimensionella (2D) tillväxt och sår-reparation analyser. Vi tillhandahåller också metodiken för analys av tidsfördröjningsavbildningsdata för att bestämma cellströmsbildning och riktningsmotilitet.
Abstract
Utvecklingen av gommen är en dynamisk process, som innebär vertikal tillväxt av bilaterala palatala hyllor bredvid tungan följt av höjd och fusion ovanför tungan. Defekter i denna process leder till gomspalt, en vanlig missbildning. Nyligen genomförda studier har visat att palatal hyllhöjd innebär en ombyggnadsprocess som omvandlar orienteringen av hyllan från en vertikal till en horisontell. Rollen av palatal hyll mesenchymal celler i denna dynamiska ombyggnad har varit svårt att studera. Time-lapse-imaging-baserade kvantitativ analys har nyligen använts för att visa att primära mus embryonala palatal mesenchymal (MEPM) celler kan självorganisera sig i en kollektiv rörelse. Kvantitativa analyser kan identifiera skillnader i mutanta MEPM celler från en mus modell med gommen höjd defekter. Detta dokument beskriver metoder för att isolera och odla MEPM celler från E13.5 embryon-specifikt för time-lapse imaging-och att bestämma olika cellulära attribut för kollektiv rörelse, inklusive åtgärder för ström bildas, form justering och uthållighet av riktning. Det hävdar att MEPM-celler kan fungera som en proxymodell för att studera rollen som palatalhylla mesenchyme under den dynamiska höjdprocessen. Dessa kvantitativa metoder kommer att göra det möjligt för utredare i kraniofacial fältet att bedöma och jämföra kollektiva rörelse attribut i kontroll och mutanta celler, vilket kommer att öka förståelsen för mesenchymal ombyggnad under palatal hyll höjd. Dessutom ger MEPM-celler en sällsynt mesenchymal cellmodell för undersökning av kollektiva cellrörelser i allmänhet.
Introduction
Gomutveckling har studerats i stor utsträckning eftersom defekter i palatogenesis leder till gomspalt- en vanlig fosterskada som uppstår i isolerade fall eller som en del av hundratals syndrom1,2. Utvecklingen av den embryonala gommen är en dynamisk process som innebär rörelse och fusion av embryonal vävnad. Denna process kan delas in i fyra stora steg: 1) induktion av palatala hyllor, 2) vertikal tillväxt av palatala hyllorna bredvid tungan, 3) höjden av palatalhyllorna ovanför tungan och 4) fusion av palatalhyllorna vid mitten av1,3,4. Under de senaste decennierna har många musmutanter identifierats som manifesterar gomspalt5,6,7,8. Karakterisering av dessa modeller har indikerat defekter i palatal hyll induktion, spridning, och fusion steg; Palatal hyll höjd defekter har dock varit sällsynta. Således är förståelsen av dynamiken i palatal hyllhöjd ett spännande forskningsområde.
Noggrann analys av vissa musmutanter med palatala hyllhöjdsdefekter har lett till den nuvarande modellen som visar att den mycket främre regionen i palatalhyllan verkar vända upp, medan en vertikal till horisontell rörelse eller “ombyggnad” av palatalhyllorna sker i mitten till bakre regioner i gommen1,3,4, 9,10,11. Den mediala kanten epitel av palatalhyllan initierar sannolikt den signalering som krävs för denna ombyggnad, som sedan drivs av palatalhylla mesenchyme. Nyligen har många forskare identifierat palatal hyllhöjdsfördröjning i musmodeller som visade övergående orala vidhäftningar med palatalahyllor 12,13. Den mesenkymala ombyggnaden innebär omorganisering av cellerna för att skapa en utbuktning i horisontell riktning, samtidigt som den drar tillbaka palatalhyllan i vertikal riktning9,10,14. Bland de flera mekanismer som föreslås påverka palatalhylla höjd och den underliggande mesenkymala ombyggnad är cellproliferation15,16,17, chemotactic gradienter18och extracellulära matriskomponenter19,20. En viktig fråga uppstod: är palatalhylla höjd försening observeras i Specc1l-bristfälligamöss också delvis på grund av en defekt i palatalhyllan ombyggnad, och kan denna ombyggnad defekt manifestera i en inneboende defekt i beteendet hos primära MEPM celler21?
Primära MEPM-celler har använts inom kraniofacialområdet för många studier med genuttryck22,23,24,25,26,27,28,29och några som involverar spridning30,31 och migration25,31,32 , men ingen för analys av kollektivt cellbeteende. Time-lapse imaging av MEPM-celler utfördes i 2D-odling och sårreparationsanalyser för att visa att MEPM-celler visade riktningsrörelse och bildade densitetsberoende cellströmmar-attribut för kollektiv rörelse21. Dessutom bildade Specc1l mutanta celler smalare cellströmmar och visade mycket varierande cellmigreringsbanor. Denna brist på samordnad motilitet anses bidra till gommens höjdfördröjning i Specc1l mutanta embryon13,21. Således kan dessa relativt enkla analyser med primära MEPM-celler fungera som en proxy för att studera mesenchymal ombyggnad under palatal hyllhöjd. Detta dokument beskriver isolering och kultur av primära MEPM celler, liksom tidsfördröjning imaging och analys, för 2D och sår-reparation analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Palatal hylla höjd utgör en vertikal till horisontell ombyggnad händelse1,3,4,9,11. Det är postulerat att denna ombyggnadsprocess kräver palatal hyll mesenchymal celler att bete sig samordnat. Analyserna med MEPM-celler av vildtyp visar att cellbeteendet är inneboende och kan mängderas21. Således kan dessa analyser användas fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes delvis av National Institutes of Health grants DE026172 (I.S.) och GM102801 (A.C.). I.S. stöddes också delvis av Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) och Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
