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Biochemistry

Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

Published: February 04, 2021
doi:
10.3791/62180
, , , ,
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Qui viene presentata una procedura per esprimere e purificare la miosina 5a seguita da una discussione sulla sua caratterizzazione, utilizzando sia l’ensemble che la singola molecola in saggi basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro, e come questi metodi possono essere modificati per la caratterizzazione della miosina 2b non a forma di molecola.

Abstract

Le proteine della miosina si legano e interagiscono con l’actina filamentosa (F-actina) e si trovano negli organismi attraverso l’albero filogenetico. La loro struttura e le proprietà enzimatiche sono adattate alla particolare funzione che eseguono nelle cellule. La miosina 5a cammina processivamente sulla F-actina per trasportare melanosomi e vescicole nelle cellule. Al contrario, la miosina 2b nonmuscolare funziona come un filamento bipolare contenente circa 30 molecole. Sposta F-actina di polarità opposta verso il centro del filamento, dove le molecole di miosina lavorano in modo asincrono per legare l’actina, impartire un colpo di potenza e dissociarsi prima di ripetere il ciclo. La miosina 2b nonmuscolare, insieme alle sue altre isoforme di miosina 2 non muscolari, ha ruoli che includono l’adesione cellulare, la citochinesi e il mantenimento della tensione. La meccanochimica delle miosine può essere studiata eseguendo saggi di motilità in vitro utilizzando proteine purificate. Nel test del filamento di actina planante, le miosine sono legate a una superficie di copertura del microscopio e traslocano F-actina etichettata fluorescentemente, che può essere tracciata. Nel test di motilità a singola molecola/insieme, tuttavia, la F-actina è legata a un coverslip e si osserva il movimento di molecole di miosina etichettate fluorescentmente sulla F-actina. In questo rapporto, viene delineata la purificazione della miosina 5a ricombinante da cellule Sf9 utilizzando la cromatografia di affinità. Successivamente, delineiamo due saggi basati sulla microscopia a fluorescenza: il test del filamento di actina planante e il test di motilità invertita. Da questi saggi, parametri come le velocità di traslocazione dell’actina e le lunghezze e le velocità di esecuzione delle singole molecole possono essere estratti utilizzando il software di analisi delle immagini. Queste tecniche possono anche essere applicate per studiare il movimento di singoli filamenti delle isoforme di miosina 2 non-movimento, qui discusse nel contesto della miosina 2b non-muscolare. Questo flusso di lavoro rappresenta un protocollo e un insieme di strumenti quantitativi che possono essere utilizzati per studiare la dinamica della singola molecola e dell’insieme delle miosine nonmuscolari.

Introduction

Le miosine sono proteine motorie che esercitano forza sui filamenti di actina utilizzando l’energia derivata dall’idrolisi dell’adenosina trifosfato (ATP)1. Le miosine contengono un dominio della testa, del collo e della coda. Il dominio della testa contiene la regione di legame con l’actina e il sito di legame e idrolisi dell’ATP. I domini del collo sono composti da motivi QI, che si legano a catene leggere, calmodulina o proteine simili a calmoduline2,3. La regione della coda ha diverse funzioni specifiche per ogni classe di miosine, tra cui, ma non solo, la dimerizzazione di due catene pesanti, il legame delle molecole di carico e la regolazione della miosina tramite interazioni autoinibitorie con i domini della testa1.

Le proprietà mobili della miosina variano notevolmente tra le classi. Alcune di queste proprietà includono il rapporto di servizio (la frazione del ciclo meccanico della miosina in cui la miosina è legata all’actina) e la processività (la capacità di un motore di fare più passi sul suo binario prima del distacco)4. Le oltre 40 classi di miosine sono state determinate sulla base di analisi di sequenza5,6,7,8. Le miosine di classe 2 sono classificate come “convenzionali” poiché sono state le prime ad essere studiate; tutte le altre classi di miosine sono, quindi, classificate come “non convenzionali”.

La miosina 5a (M5a) è una miosina di classe 5 ed è un motore processivo, il che significa che può fare più passi lungo l’actina prima di dissociarsi. Ha un elevato rapporto di servizio, che indica che trascorre gran parte del suo ciclo meccanico legato all’actina9,10,11,12,13,14. In comune con altre miosine, la catena pesante contiene un dominio motorio N-terminale che include sia un sito di idrolisi dell’actina che un sito di idrolisi dell’ATP seguito da una regione del collo che funge da braccio a leva, con sei motivi QI che si legano alle catene leggere essenziali (ELC) e alla calmodulina (CaM)15. La regione della coda contiene α bobine arrotolate elicoidali, che dimerizzano la molecola, seguite da una regione di coda globulare per legare il carico. La sua cinetica riflette il suo coinvolgimento nel trasporto dei melanosomi nei melanociti e del reticolo endoplasmatico nei neuroni di Purkinje16,17. M5a è considerato il prototipo del motore di trasporto merci18.

Le miosine di classe 2, o le miosine convenzionali, includono le miosine che alimentano la contrazione della muscolatura scheletrica, cardiaca e liscia oltre alle isoforme di miosina 2 (NM2) non muscolare, NM2a, 2b e 2c19. Le isoforme NM2 si trovano nel citoplasma di tutte le cellule e hanno ruoli condivisi nella citochinesi, nell’adesione, nella morfogenesi tissutale e nella migrazione cellulare19,20,21,22. Questo articolo discute i protocolli convenzionali della miosina nel contesto della miosina 2b nonmuscolare (NM2b)23. NM2b, rispetto a M5a, ha un basso rapporto di servizio ed è enzimaticamente più lento con un Vmax di 0,2 s-123 rispetto al Vmax di M5a di ≈18 s-124. In particolare, i costrutti NM2b troncati con due teste non si muovono facilmente processivamente sull’actina; piuttosto, ogni incontro con l’actina si traduce in un colpo di potenza seguito dalla dissociazione della molecola25.

NM2b contiene due catene pesanti di miosina, ciascuna con un dominio della testa globulare, un braccio a leva (con un ELC e una catena leggera regolatoria (RLC)) e un dominio di asta / coda a spirale α-elicoidale, lungo circa 1.100 amminoacidi, che dimerizza queste due catene pesanti. L’attività enzimatica e lo stato strutturale di NM2b sono regolati dalla fosforilazione del RLC23. NM2b non fosforilato, in presenza di ATP e forze ioniche fisiologiche (circa 150 mM di sale), adotta una conformazione compatta in cui le due teste rendono partecipe un’interazione asimmetrica e la coda si ripiega indietro sopra le teste in due punti23. In questo stato, la miosina non interagisce fortemente con l’actina e ha un’attività enzimatica molto bassa. Dopo la fosforilazione RLC da parte della miosina chinasi a catena leggera calmodulina-dipendente (MLCK) o chinasi proteica associata a Rho, la molecola si estende e si associa ad altre miosine attraverso la regione della coda per formare filamenti bipolari di circa 30 molecole di miosina23. La già citata fosforilazione del RLC porta anche ad un aumento dell’attività ATPasi attivata da actina di NM2b di circa quattro volte26,27,28. Questa disposizione del filamento bipolare, con molti motori a miosina ad ogni estremità, è ottimizzata per ruoli nella contrazione e nel mantenimento della tensione, dove i filamenti di actina con polarità opposte possono essere spostati l’uno rispetto all’altro23,29. Di conseguenza, NM2b ha dimostrato di agire come un insieme di motori quando interagisce con l’actina. Il gran numero di motori all’interno di questo filamento consente ai filamenti NM2b di muoversi processivamente sui filamenti di actina, rendendo possibile la processività del filamento in vitro per caratterizzare29.

Mentre sono stati fatti progressi nella comprensione del ruolo delle miosine nella cellula, è necessario comprendere le loro caratteristiche individuali a livello proteico. Per comprendere le interazioni dell’actomiosina a un semplice livello di interazione proteina-proteina, piuttosto che all’interno di una cellula, possiamo esprimere e purificare le miosine ricombinanti per l’uso in studi in vitro. I risultati di tali studi informano quindi i meccanobiologi sulle proprietà biofisiche di specifiche miosine che alla fine guidano processi cellulari complessi12,13,14,25,29. Tipicamente, questo si ottiene aggiungendo un tag di affinità a un costrutto di miosina a lunghezza intera o troncato e purificando tramite cromatografia di affinità29,30,31. Inoltre, il costrutto può essere progettato per includere un fluoroforo geneticamente codificabile o un tag per l’etichettatura delle proteine con un fluoroforo sintetico. Aggiungendo una tale etichetta fluorescente, è possibile eseguire studi di imaging a singola molecola per osservare la meccanica e la cinetica della miosina.

Dopo la purificazione, la miosina può essere caratterizzata in diversi modi. L’attività dell’ATPasi può essere misurata con metodi colorimetrici, fornendo informazioni sul consumo energetico complessivo e sull’affinità con l’actina del motore in diverse condizioni32. Per conoscere la meccanochimica della sua motilità, sono necessari ulteriori esperimenti. Questo documento descrive in dettaglio due metodi in vitro basati sulla microscopia a fluorescenza che possono essere utilizzati per caratterizzare le proprietà mobili di una proteina della miosina purificata.

Il primo di questi metodi è il test del filamento di actina planante, che può essere utilizzato per studiare quantitativamente le proprietà dell’insieme dei motori della miosina, nonché per studiare qualitativamente la qualità di un lotto di proteinapurificata 33. Sebbene questo documento discuta l’uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per questo test, questi esperimenti possono essere eseguiti efficacemente utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una fotocamera digitale, comunemente presente in molti laboratori34. In questo test, uno strato saturante di motori a miosina è attaccato a un coverslip. Ciò può essere realizzato utilizzando nitrocellulosa, anticorpi, membrane, superfici derivatizzate da SiO2(come il trimetilorilclorosilano), tra gli altri29,33,35,36,37,38. I filamenti di actina etichettati fluorescentemente vengono passati attraverso la camera di copertura, su cui l’actina si lega alla miosina attaccata alla superficie. Dopo l’aggiunta di ATP (e chinasi nello studio di NM2), la camera viene emersa per osservare la traslocazione dei filamenti di actina da parte delle miosine legate alla superficie. Il software di tracciamento può essere utilizzato per correlare la velocità e la lunghezza di ciascun filamento di actina planante. Il software di analisi può anche fornire una misura del numero di filamenti di actina sia in movimento che stazionari, che può essere utile per determinare la qualità di un determinato preparato di miosina. La proporzione di filamenti in stallo può anche essere intenzionalmente modulata mediante il legame superficiale dell’actina ad altre proteine e misurata per determinare la dipendenza dal carico della miosina39. Poiché ogni filamento di actina può essere spinto da un gran numero di motori disponibili, questo saggio è molto riproducibile, con la velocità finale misurata che è robusta a perturbazioni come alterazioni nella concentrazione di miosina iniziale o la presenza di fattori aggiuntivi nella soluzione. Ciò significa che può essere facilmente modificato per studiare l’attività della miosina in diverse condizioni, come fosforilazione alterata, temperatura, resistenza ionica, viscosità della soluzione e gli effetti del carico indotto dai ladri superficiali. Sebbene fattori come le “teste morte” di miosina fortemente leganti incapaci di idrolisi dell’ATP possano causare filamenti di actina in stallo, esistono diversi metodi per mitigare tali problemi e consentire misurazioni accurate. Le proprietà cinetiche della miosina variano notevolmente tra le classi e, a seconda della miosina specifica utilizzata, la velocità di scorrimento del filamento di actina in questo test può variare da meno di 20 nm/ s (miosina 9)40,41e fino a 60.000 nm / s(characean miosina 11)42.

Il secondo saggio inverte la geometria del saggio del filamento di actina planante12. Qui, i filamenti di actina sono attaccati alla superficie del coverslip e viene visualizzato il movimento di singole molecole di M5a o di singoli filamenti bipolari di NM2b. Questo test può essere utilizzato per quantificare le lunghezze e le velocità di corsa di singole molecole di miosina o filamenti su actina. Un coverslip è rivestito con un composto chimico che blocca il legame non specifico e contemporaneamente funzionalizza la superficie, come la biotina-polietilenglicole (biotina-PEG). L’aggiunta di derivati avidici modificati innesca quindi la superficie e l’actina biotinilata viene fatta passare attraverso la camera, risultando in uno strato di F-actina stabilmente legato al fondo della camera. Infine, la miosina attivata ed etichettata fluorescentemente (tipicamente 1-100 nM) viene fatto scorrere attraverso la camera, che viene quindi cioè cioè per osservare il movimento della miosina sui filamenti stazionari di actina.

Queste modalità rappresentano metodi veloci e riproducibili che possono essere impiegati per esaminare la dinamica delle miosine non muscolari e muscolari. Questo rapporto delinea le procedure per purificare e caratterizzare sia M5a che NM2b, che rappresentano rispettivamente miosine non convenzionali e convenzionali. Questo è seguito da una discussione di alcuni degli adattamenti specifici della miosina, che possono essere eseguiti per ottenere una cattura di successo del movimento nei due tipi di test.

Espressione e biologia molecolare
Il cDNA per la miosina di interesse deve essere clonato su un vettore pFastBac1 modificato che codifica per un tag FLAG-terminale C (DYKDDDDK) se esprime M5a-HMM, o un tag FLAG N-terminale se esprime la molecola a lunghezza intera di NM2b23,43,44,45,46. I tag FLAG C-terminali su NM2b provocano un’affinità indebolita della proteina per la colonna di affinità FLAG. Al contrario, la proteina N-terminale contrassegnata con FLAG di solito si lega bene alla colonna di affinità FLAG23. La proteina N-terminalemente marcata mantiene l’attività enzimatica, l’attività meccanica e la regolazione dipendente dalla fosforilazione23.

In questo articolo, è stato utilizzato un costrutto di meromiosina pesante M5a (HMM) con un GFP tra il tag FLAG e il C-terminus della catena pesante di miosina. Si noti che, a differenza di NM2b, M5a-HMM può essere taggato e purificato con tag FLAG N o C-terminal e in entrambi i casi il costrutto risultante sarà attivo. La catena pesante M5a è stata troncata all’amminoacido 1090 e contiene un linker di tre amminoacidi (GCG) tra la GFP e la regione a spirale dell’M5a47. Non è stato aggiunto alcun linker aggiuntivo tra il GFP e il tag FLAG. M5a-HMM è stato co-espresso con calmodulin. Il costrutto NM2b umano a lunghezza intera è stato co-espresso con ELC e RLC. L’N-termini del RLC è stato fuso con un GFP tramite un linker di cinque aminoacidi (SGLRS). Direttamente attaccato al flag-tag c’era un HaloTag. Tra l’HaloTag e l’N-terminus della catena pesante della miosina c’era un linker fatto di due amminoacidi (AS).

Entrambi i preparati di miosina sono stati purificati da un litro di coltura cellulare Sf9 infettata da baculovirus ad una densità di circa 2 x 106 cellule / mL. I volumi del baculovirus per ciascuna subunità dipendevano dalla molteplicità di infezione del virus determinata dalle istruzioni del produttore. Nel caso di M5a, le cellule sono state co-infettate con due diversi baculovirus: uno per calmodulin e uno per M5a catena pesante. Nel caso dell’NM2b, le cellule sono state co-infettate con tre diversi virus: uno per eLC, uno per RLC e uno per la catena pesante NM2b. Per i laboratori che lavorano con una varietà di miosine (o altre proteine multi-complesse), questo approccio è efficiente poiché consente molte combinazioni di catene pesanti e leggere e catene leggere comunemente usate come la calmodulina possono essere co-trasfettate con molte diverse catene pesanti di miosina. Tutto il lavoro cellulare è stato completato in un armadio di biosicurezza con una tecnica sterile adeguata per evitare la contaminazione.

Per l’espressione sia di M5a che di NM2b, le cellule Sf9 che producono le miosine ricombinanti sono state raccolte 2-3 giorni dopo l’infezione, tramite centrifugazione, e conservate a -80 °C. I pellet cellulari sono stati ottenuti centrifugando le cellule Sf9 co-infette a 4 °C per 30 minuti a 2.800 x g. Il processo di purificazione delle proteine è dettagliato di seguito.

Protocol

1. Purificazione delle proteine Lisi cellulare ed estrazione di proteine Preparare un buffer di estrazione 1,5x basato sulla tabella 1. Filtrare e conservare a 4 °C. Iniziare a scongelare i pellet cellulari sul ghiaccio. Mentre i pellet si scongelano, integrare 100 mL di tampone di estrazione con 1,2 mM di ditiotrireitolo (DTT), 5 μg / mL leupeptina, 0,5 μM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e due compresse inibitori della proteasi. Continua sul ghiaccio. Una vo…

Representative Results

La purificazione della miosina può essere valutata eseguendo l’elettroforesi gel-elettroforesi riducente sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) come mostrato in Figura 2. Mentre questa cifra rappresenta la miosina finale post-dializzato, SDS-PAGE può essere eseguita su aliquote dalle varie fasi della procedura di purificazione per identificare eventuali prodotti persi dal surnatante. Myosin 5a HMM ha una banda nella gamma 120-130 kDa e la miosina nonmuscolare a lunghezza intera 2…

Discussion

Qui viene presentato un flusso di lavoro per la purificazione e la caratterizzazione in vitro della miosina 5a e della miosina 2b nonmuscolare. Questo insieme di esperimenti è utile per quantificare le proprietà meccanochimiche dei costrutti di miosina purificati in modo rapido e riproducibile. Sebbene le due miosine mostrate qui siano solo due esempi specifici tra le molte possibilità, le condizioni e le tecniche possono essere applicate, con qualche personalizzazione, alla maggior parte delle miosine e a molte altre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Fang Zhang per l’assistenza tecnica nella preparazione dei reagenti utilizzati per la raccolta di questi dati. Questo lavoro è stato supportato dal NHLBI / NIH Intramural Research Program finanzia HL001786 a J.R.S.

Materials

1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper – Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper – Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish – Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish – Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
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Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).
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