JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Published: February 04, 2021
doi:
10.3791/62180
, , , ,
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.

Abstract

Белки миозина связываются и взаимодействуют с нитевидным актином (F-актином) и обнаруживаются в организмах по всему филогенетическому дереву. Их структура и ферментативные свойства адаптированы к конкретной функции, которую они выполняют в клетках. Миозин 5а процессивно ходит по F-актину для транспортировки меланосом и везикул в клетках. И наоборот, немуздровой миозин 2b действует как биполярная нить, содержащая примерно 30 молекул. Он перемещает F-актин противоположной полярности к центру нити, где молекулы миозина работают асинхронно, чтобы связать актин, придать силовой удар и диссоциировать перед повторением цикла. Немуздрочный миозин 2b, наряду с другими его немузкулистыми изоформами миозина 2, имеет роли, которые включают клеточную адгезию, цитокинез и поддержание напряжения. Механохимия миозинов может быть изучена путем выполнения анализов подвижности in vitro с использованием очищенных белков. В скользящем актиновом анализе миозины связываются с поверхностью крышки микроскопа и транслокируют флуоресцентно меченый F-актин, который можно отслеживать. Однако в анализе подвижности одной молекулы/ансамбля F-актин связан с покровным листом, и наблюдается движение флуоресцентно меченых молекул миозина на F-актине. В этом отчете описана очистка рекомбинантного миозина 5а из клеток Sf9 с помощью аффинной хроматографии. После этого мы опишем два анализа на основе флуоресцентной микроскопии: анализ скользящей актиновой нити и анализ перевернутой подвижности. Из этих анализов такие параметры, как скорости транслокации актина и длины и скорости пробега одной молекулы, могут быть извлечены с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Эти методы также могут быть применены для изучения движения одиночных нитей немышечные изоформы миозина 2, обсуждаемые в настоящем документе в контексте немузкусного миозина 2b. Этот рабочий процесс представляет собой протокол и набор количественных инструментов, которые могут быть использованы для изучения динамики одной молекулы и ансамбля немуклетковых миозидов.

Introduction

Миозины представляют собой моторные белки, которые оказывают силу на актиновые нити, используя энергию, полученную в результате гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ)1. Миозины содержат область головы, шеи и хвоста. Головной домен содержит актин-связывающую область, а также место связывания и гидролиза АТФ. Шейные домены состоят из мотивов IQ, которые связываются с легкими цепями, кальмодулином или кальмодулиноподобными белками2,3. Хвостовая область имеет несколько функций, специфичных для каждого класса миозинов, включая, но не ограничиваясь, димеризацией двух тяжелых цепей, связыванием молекул груза и регуляцией миозина посредством аутоингибиторных взаимодействий с головными доменами1.

Подвижные свойства миозина сильно различаются между классами. Некоторые из этих свойств включают коэффициент нагрузки (доля механического цикла миозина, в которой миозин связан с актином) и процессучность (способность двигателя делать несколько шагов на своем пути перед отслоением)4. Более 40 классов миозинов были определены на основе последовательности анализов5,6,7,8. Миозины класса 2 классифицируются как «обычные», поскольку они были первыми, которые были изучены; поэтому все другие классы миозинов классифицируются как «нетрадиционные».

Миозин 5а (M5a) является миозином класса 5 и является процессивным двигателем, что означает, что он может делать несколько шагов вдоль актина перед диссоциацией. Он имеет высокий коэффициент полезного действия, что указывает на то, что он проводит большую часть своего механическогоцикла,связанного с актином9,10,11,12,13,14. Как и другие миозины, тяжелая цепь содержит N-концевой двигательный домен, который включает в себя как актин-связывание, так и сайт гидролиза АТФ, за которым следует область шеи, которая служит рычагом-рычагом, с шестью мотивами IQ, которые связываются с основными легкими цепями (ELC) и кальмодулином (CaM)15. Хвостовая область содержит α спиральные спиральные катушки, которые димеризируют молекулу, за которой следует шаровидная хвостовая область для связывания груза. Его кинетика отражает его участие в транспорте меланосом в меланоцитах и эндоплазматического ретикулума в нейронах Пуркинье16,17. М5а считается прототипом грузового транспортногомотора 18.

Миозины класса 2, или обычные миозины, включают миозины, которые обеспечивают сокращение скелетных, сердечных и гладких мышц в дополнение к немуусочковым изоформам миозина 2 (NM2), NM2a, 2b и 2c19. Изоформы NM2 находятся в цитоплазме всех клеток и играют общую роль в цитокинезе, адгезии, тканевом морфогенезе и миграции клеток19,20,21,22. В данной статье обсуждаются обычные протоколы миозина в контексте немузкулового миозина 2b (NM2b)23. NM2b, по сравнению с M5a, имеет низкий коэффициент нагрузки и ферментарно медленнее с Vmax 0,2 с-123 по сравнению с M5a Vmax ≈18 с-124. Примечательно, что усеченные конструкции NM2b с двумя головками не легко перемещаются процессно на актине; скорее, каждая встреча с актином приводит к силовому удару с последующей диссоциацией молекулы25.

NM2b содержит две тяжелые цепи миозина, каждая с одним шаровидным головным доменом, одним рычагом-рычагом (с одним ELC и одной регуляторной легкой цепью (RLC)) и α-спиральным спиральным стержнем / хвостовым стержнем, длиной примерно 1 100 аминокислот, который димеризует эти две тяжелые цепи. Ферментативная активность и структурное состояние NM2b регулируются фосфорилированием RLC23. Нефосфорилированный NM2b, в присутствии АТФ и физиологических ионных сил (приблизительно 150 мМ соли), принимает компактную конформацию, в которой две головки участвуют в асимметричном взаимодействии, а хвостовые складки возвращаются над головами в двух местах23. В этом состоянии миозин не взаимодействует сильно с актином и обладает очень низкой ферментативной активностью. При фосфорилировании RLC кальмодулин-зависимой миозин-цепной киназой (MLCK) или Rho-ассоциированной протеинкиназой молекула расширяется и связывается с другими миозинами через хвостовую область с образованием биполярных нитей примерно из 30 молекул миозина23. Вышеупомянутое фосфорилирование RLC также приводит к повышению актин-активированной АТФазной активности NM2b примерно в четыре разав 26,27,28. Это биполярное расположение нити накала, имеющее множество миозиновых двигателей на каждом конце, оптимизировано для ролей в сжатии и поддержании напряжения, где актиновые нити с противоположными полярностями могут перемещаться относительно друг друга23,29. Соответственно, было показано, что NM2b действует как ансамбль двигателей при взаимодействии с актином. Большое количество двигателей в этой нити накала позволяют нитям NM2b двигаться процессно на актиновых нитях, что делает возможным характеристику процессичности нити in vitro дляхарактеристики 29.

Хотя был достигнут прогресс в понимании роли миозинов в клетке, необходимо понимать их индивидуальные особенности на уровне белка. Чтобы понять взаимодействия актомиозина на простом уровне белково-белкового взаимодействия, а не внутри клетки, мы можем экспрессировать и очищать рекомбинантные миозины для использования в исследованиях in vitro. Результаты таких исследований затем информируют механобиологов о биофизических свойствах специфических миозидов, которые в конечном итоге управляют сложными клеточными процессами12,13,14,25,29. Как правило, это достигается путем добавления метки аффинности к полноразмерной или усеченной конструкции миозина и очистки с помощью аффинной хроматографии29,30,31. Кроме того, конструкция может быть спроектирована так, чтобы включать генетически кодируемый флуорофор или метку для маркировки белка синтетическим флуорофором. Добавляя такую флуоресцентную метку, можно проводить исследования визуализации одной молекулы для наблюдения за механикой миозина и кинетикой.

После очищения миозин можно охарактеризовать несколькими способами. Активность АТФазы может быть измерена колориметрическими методами, обеспечивающими понимание общего энергопотребления и актинового сродства двигателя в различных условиях32. Чтобы узнать о механохимии его подвижности, требуются дальнейшие эксперименты. В этой статье подробно описываются два метода на основе флуоресцентной микроскопии in vitro, которые могут быть использованы для характеристики подвижных свойств очищенного белка миозина.

Первым из этих методов является скользящий актиновый анализ нити, который может быть использован для количественного изучения ансамблевых свойств миозиновых двигателей, а также качественного изучения качества партии очищенного белка33. Хотя в этой статье обсуждается использование микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) для этого анализа, эти эксперименты могут быть эффективно выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, обычно встречающегося во многих лабораториях34. В этом анализе насыщающий слой миозиновых двигателей прикрепляется к покровному слипу. Это может быть достигнуто с использованием нитроцеллюлозы, антител, мембран, SiO2-производныхповерхностей (таких как триметилхлорсилан), среди прочих29,33,35,36,37,38. Флуоресцентно меченые актиновые нити пропускаются через камеру крышки, на которой актин связывается с миозином, прикрепленным к поверхности. При добавлении АТФ (и киназ при исследовании NM2) камера визуалируется для наблюдения за транслокацией актиновых нитей поверхностно связанными миозинами. Программное обеспечение для отслеживания может использоваться для корреляции скорости и длины каждой скользящей актинной нити. Программное обеспечение для анализа может также обеспечить измерение количества как движущихся, так и стационарных актиновых нитей, что может быть полезно для определения качества данного препарата миозина. Пропорция заглохших нитей также может быть намеренно модулирована поверхностным привязыванием актина к другим белкам и измерена для определения зависимости нагрузки миозина39. Поскольку каждая нить актина может приводиться в движение большим количеством доступных двигателей, этот анализ очень воспроизводим, причем конечная измеренная скорость устойчива к возмущениям, таким как изменения в начальной концентрации миозина или присутствие дополнительных факторов в растворе. Это означает, что его можно легко модифицировать для изучения активности миозина в различных условиях, таких как измененное фосфорилирование, температура, ионная прочность, вязкость раствора и эффекты нагрузки, вызванной поверхностными тросами. Хотя такие факторы, как сильно связывающие «мертвые головки» миозина, неспособные к гидролизу АТФ, могут вызвать застойные актиновые нити, существует несколько методов, позволяющих смягчить такие проблемы и обеспечить точные измерения. Кинетические свойства миозина сильно различаются в зависимости от классов и, в зависимости от конкретного используемого миозина, скорость скольжения актиновой нити в этом анализе может варьироваться от менее 20 нм / с (миозин 9)40,41и до 60 000 нм / с(Characean myosin 11)42.

Второй анализ инвертирует геометрию скользящей актиновой нитианализа 12. Здесь актиновые нити прикрепляются к поверхности покрова и визуализируется движение одиночных молекул M5a или отдельных биполярных нитей NM2b. Этот анализ может быть использован для количественной оценки длины пробега и скоростей отдельных молекул миозина или нитей на актине. Покров покрывается химическим соединением, которое блокирует неспецифическое связывание и одновременно функционализирует поверхность, таким как биотин-полиэтиленгликоль (биотин-ПЭГ). Добавление модифицированных производных авидина затем грунтует поверхность, и биотинилированный актин пропускают через камеру, в результате чего слой F-актина стабильно связывается с нижней частью камеры. Наконец, активированный и флуоресцентно меченый миозин (обычно 1-100 нМ) протекает через камеру, которая затем визуализируется для наблюдения за движением миозина над стационарными актиновым нитями.

Эти модальности представляют собой быстрые и воспроизводимые методы, которые могут быть использованы для изучения динамики как немуечных, так и мышечных миозинов. В этом отчете описываются процедуры очистки и характеристики как M5a, так и NM2b, представляющие собой нетрадиционные и обычные миозины, соответственно. За этим следует обсуждение некоторых миозин-специфических адаптаций, которые могут быть выполнены для достижения успешного захвата движения в двух типах анализа.

Экспрессия и молекулярная биология
КДНК для интересующего миозина должна быть клонирована на модифицированный вектор pFastBac1, который кодирует либо C-концевой FLAG-тег (DYKDDDDK), если экспрессирует M5a-HMM, либо N-концевой FLAG-метки, если экспрессирует полноразмерную молекулу NM2b23,43,44,45,46. C-концевые FLAG-метки на NM2b приводят к ослаблению сродства белка к столбику FLAG-аффинности. Напротив, N-терминально помеченный FLAG белок обычно хорошо связывается с колонкой23FLAG-аффинности. N-терминально меченый белок сохраняет ферментативную активность, механическую активность и фосфорилирование-зависимую регуляцию23.

В этой статье использовалась усеченная мышь M5a тяжелая меромиозиновая (HMM)-подобная конструкция с GFP между FLAG-тегом и C-концем тяжелой цепи миозина. Обратите внимание, что в отличие от NM2b, M5a-HMM может быть успешно помечен и очищен с помощью тегов FLAG N- или C-терминала, и в обоих случаях результирующая конструкция будет активной. Тяжелая цепь M5a была усечена при аминокислоте 1090 и содержит три аминокислотных линкера (GCG) между GFP и областью катушки M5a47. Между GFP и FLAG-тегом не было добавлено дополнительного компоновщика. M5a-HMM был совместно экспрессирован с кальмодулином. Полноразмерная человеческая конструкция NM2b была выражена совместно с ELC и RLC. N-термины RLC сплавлены с GFP через линкер из пяти аминокислот (SGLRS). Непосредственно к FLAG-тегу был прикреплен HaloTag. Между HaloTag и N-концем тяжелой цепи миозина находился линкер, состоящий из двух аминокислот (AS).

Оба препарата миозина очищали от одного литра культуры клеток Sf9, инфицированной бакуловирусом, при плотности примерно 2 х 106 клеток/мл. Объемы бакуловируса для каждой субъединицы зависели от множественности инфекции вируса, определенной инструкциями производителя. В случае M5a клетки были совместно инфицированы двумя различными бакуловирусами – один для кальмодулина и один для тяжелой цепи M5a. В случае NM2b клетки были совместно инфицированы тремя различными вирусами – один для ELC, один для RLC и один для тяжелой цепи NM2b. Для лабораторий, работающих с различными миозинами (или другими многокомплексными белками), этот подход эффективен, поскольку он допускает множество комбинаций тяжелых и легких цепей, а обычно используемые легкие цепи, такие как кальмодулин, могут быть совместно трансфекционированы многими различными тяжелыми цепями миозина. Вся клеточная работа была завершена в шкафу биобезопасности с надлежащей стерильной техникой, чтобы избежать загрязнения.

Для экспрессии как M5a, так и NM2b клетки Sf9, продуцирующие рекомбинантные миозины, собирали через 2-3 дня после заражения путем центрифугирования и хранили при -80 °C. Клеточные гранулы получали центрифугированием коинфицированных клеток Sf9 при 4 °C в течение 30 мин при 2,800 х г. Процесс очистки белка подробно описан ниже.

Protocol

1. Очистка белка Лизис клеток и экстракция белка Подготовьте 1,5-кратный буфер извлечения на основе таблицы 1. Фильтровать и хранить при 4 °C. Начните размораживать гранулы клеток на льду. Пока гранулы оттаивают, дополняют 100 мл экстракционного буфера 1,2 мМ дитиотре?…

Representative Results

Очистку миозина можно оценить, выполнив восстанавливающий додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) гель-электрофорез, как показано на рисунке 2. Хотя этот рисунок представляет собой окончательный, постдиализированный миозин, SDS-PAGE может быть выполнен на аликвотах из …

Discussion

Здесь представлен рабочий процесс для очистки и характеристики in vitro миозина 5a и немузмускового миозина 2b. Этот набор экспериментов полезен для количественной оценки механохимических свойств очищенных миозиновых конструкций быстрым и воспроизводимым способом. Хотя два миозина, пока?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Фан Чжана за техническую помощь в подготовке реагентов, используемых для сбора этих данных. Эта работа была поддержана фондами NHLBI/NIH Intramural Research Program HL001786 для J.R.S.

Materials

1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper – Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper – Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish – Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish – Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O’Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

Keywords: MyosinIn VitroFluorescence MicroscopyMotility AssaysNon-muscle MyosinProtein DynamicsSingle MoleculeEnsembleCytoskeletal SystemsKinesinsDyneinsMicrotubulesNitrocelluloseFlow Chamber
check_url/62180?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image