Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm
Summary
Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.
Abstract
Le traitement de l’ARNm implique plusieurs étapes simultanées pour préparer l’ARNm à la traduction, telles que le capsulage 5′, l’addition de poly-A et l’épissage. Outre l’épissage constitutif, l’épissage alternatif de l’ARNm permet l’expression de protéines multifonctionnelles à partir d’un gène. Comme les études d’interactome sont généralement la première analyse pour des protéines nouvelles ou inconnues, l’association de la protéine appât avec des facteurs d’épissage est une indication qu’elle peut participer au processus d’épissage de l’ARNm, mais déterminer dans quel contexte ou quels gènes sont régulés est un processus empirique. Un bon point de départ pour évaluer cette fonction est l’utilisation de l’outil minigène classique. Ici nous présentons l’utilisation adenoviral de minigene d’E1A pour évaluer les changements alternatifs d’épissage après différents stimulus cellulaires d’effort. Nous avons évalué l’épissage du minigène E1A dans HEK293 surexprimant de manière stable la protéine Nek4 après différents traitements de stress. Le protocole comprend la transfection de minigène e1A, le traitement cellulaire, l’extraction d’ARN et la synthèse d’ADNc, suivis de l’analyse de PCR et de gel et de la quantification des variantes épissées d’E1A. L’utilisation de cette méthode simple et bien établie combinée à des traitements spécifiques est un point de départ fiable pour faire la lumière sur les processus cellulaires ou sur les gènes qui peuvent être régulés par l’épissage de l’ARNm.
Introduction
L’épissage est parmi les étapes les plus importantes dans le traitement eucaryote de l’ARNm qui se produit simultanément au capsulage de l’ARNm 5 et à la polyadénylation de l’ARNm 3′, comprenant l’élimination de l’intron suivie d’une jonction d’exon. La reconnaissance des sites d’épissage (SS) par l’spliceosome, un complexe ribonucléoprotéine contenant de petites ribonucléoprotéines (snRNP U1, U2, U4 et U6), de petits ARN (snRNAs) et plusieurs protéines régulatrices1 est nécessaire pour l’épissage.
Outre l’élimination des introns (épissage constitutif), chez les eucaryotes, les introns peuvent être conservés et les exons peuvent être exclus, en configurant le processus appelé épissage alternatif de l’ARNm (AS). L’épissage alternatif pré-ARNm élargit la capacité de codage des génomes eucaryotes permettant la production d’un grand nombre et diversifié de protéines à partir d’un nombre relativement faible de gènes. On estime que 95 à 100 % des ARNm humains qui contiennent plus d’un exon peuvent subir un épissage alternatif2,3. Ceci est fondamental pour les processus biologiques tels que le développement neuronal, l’activation de l’apoptose et la réponse au stress cellulaire4, fournissant à l’organisme des alternatives pour réguler le fonctionnement cellulaire en utilisant le même répertoire de gènes.
La machinerie nécessaire à l’épissage alternatif est la même que celle utilisée pour l’épissage constitutif et l’utilisation de la SS est le principal déterminant pour l’épissage alternatif. L’épissage constitutif est lié à l’utilisation de sites d’épissage forts, qui sont généralement plus similaires aux motifs de consensus pour la reconnaissance des spliceosomes5.
Les exons alternatifs sont typiquement reconnus moins efficacement que les exons constitutifs une fois que ses éléments cis-régulateurs, les séquences dans 5’SS et 3’SS flanquant ces exons, montrent une capacité de liaison inférieure au spliceosome. L’ARNm contient également des régions nommées activateurs ou silencieux situés dans les exons (activateurs d’épissage exonique (EES) et silencieux d’épissage exonique (ESS)) et les introns (exhausteurs d’épissage introniques (ISE) et silencieux d’épissage intronique (ISS)) qui améliorent ou répriment l’utilisation de l’exon, respectivement5. Ces séquences sont reconnues par des éléments trans-régulateurs, ou facteurs d’épissage (SF). Les SFs sont représentés principalement par deux familles de protéines, les facteurs d’épissage riches en sérine/arginine (SRSF) qui se lient aux ES et la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPs) qui se lient aux séquences ESSs5.
L’épissage alternatif peut être modulé par phosphorylation/déphosphorylation de trans- facteurs modifiant les interactions partenaires et la localisation cellulaire des facteurs d’épissage6,7,8. L’identification de nouveaux régulateurs des facteurs d’épissage peut fournir de nouveaux outils pour réguler l’épissage et, par conséquent, certains traitements du cancer.
Anufrieva et coll.9,dans un profil d’expression génique de puces à ADN messagère, ont observé des changements constants dans les niveaux de composants splicosomal dans 101 lignées cellulaires et après différentes conditions de stress (médicaments à base de platine, irradiation gamma, inhibiteurs de la topoisomérase, inhibiteurs de tyrosine kinase et taxanes). La relation entre le modèle d’épissage et l’efficacité de la chimiothérapie a déjà été démontrée dans les cellules cancéreuses du poumon, qui sont résistantes à la chimiothérapie, montrant des changements dans le taux de variantes de la caspase-910. Les cellules HEK293 traitées avec le panneau de chimiothérapie montrent des changements dans l’épissage avec une augmentation des variantes pro-apoptotic. Gabriel et coll.11 ont observé des changements dans au moins 700 événements d’épissage après un traitement au cisplatine dans différentes lignées cellulaires, soulignant que les voies d’épissage sont affectées par le cisplatine. Les modulateurs d’épissage ont déjà démontré une activité antitumorale, montrant que l’épissage est important pour le développement tumoral et, principalement, la réponse chimiothérapeutique12. Par conséquent, caractériser de nouvelles protéines qui régulent l’épissage après les agents de stress cellulaires, comme les agents chimiothérapeutiques, est très important pour découvrir de nouvelles stratégies de traitement.
Les indices de régulation alternative d’épissage des études d’interactome, particulièrement importants pour caractériser des fonctions des protéines nouvelles ou non caractérisées, peuvent exiger une approche plus générale et simple pour vérifier le rôle réel de la protéine dans l’AS. Les minigènes sont des outils importants pour l’analyse du rôle général d’une protéine affectant la régulation de l’épissage. Ils contiennent des segments d’un gène d’intérêt contenant alternativement des régions génomiques épissées et flanquantes13. L’utilisation d’un outil de minigène permet l’analyse de l’épissage in vivo avec plusieurs avantages tels que la longueur du minigène qui est mineure et n’est donc pas une limitation à la réaction d’amplification; le même minigène peut être évalué dans différentes lignées cellulaires; tous les composants cellulaires, principalement leur modification post-traductionnelle régulatrice (phosphorylation et changements dans les compartiments cellulaires) sont présents et peuvent être traités13,14. De plus, des changements dans le modèle d’épissage alternatif peuvent être observés après le stress cellulaire et, l’utilisation d’un système minigène, permettent d’identifier la voie modulée par différents stimuli.
Il existe plusieurs systèmes de minigènes déjà décrits qui sont spécifiques à différents types d’événements d’épissage13,14,cependant, en tant qu’essai préliminaire, le minigène E1A15 est un système de rapporteur d’épissage alternatif très bien établi pour l’étude de la sélection 5’SS in vivo. À partir d’un seul gène, E1A, cinq ARNm sont produits par épissage alternatif basé sur la sélection de trois sites d’épissure 5′ différents et d’un site d’épissure majeur ou mineur de 3′16,17,18. L’expression des variantes E1A change en fonction de la période d’infection adénovirale19,20.
Nous avons montré précédemment que les deux isoformes Nek4 interagissent avec des facteurs d’épissage tels que SRSF1 et hnRNPA1 et tandis que l’isoforme 2 change l’épissage alternatif minigène E1A, l’isoforme 1 n’a aucun effet en ce que21. Puisque l’isoforme 1 est l’isoforme la plus abondante et change la résistance de chimiothérapie et la réponse aux dommages d’ADN, nous évaluons si elle pourrait changer l’épissage alternatif du minigène E1A dans un état de stress.
Le dosage minigène est une méthode simple, peu coûteuse et rapide, car il ne nécessite que l’extraction de l’ARN, la synthèse de l’ADNc, l’amplification et les analyses de gel d’agarose, et peut être un outil utile pour évaluer depuis un effet possible sur l’épissage alternatif par une protéine d’intérêt jusqu’à l’effet de différents traitements sur le modèle d’épissage alternatif cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les minigènes sont des outils importants pour déterminer les effets de l’épissage alternatif global in vivo. Le minigène adénoviral E1A est utilisé avec succès depuis des décennies pour évaluer le rôle des protéines en augmentant la quantité de celles-ci dans la cellule13,14. Ici, nous proposons l’utilisation du minigene E1A pour évaluer l’épissage alternatif après exposition chimiothérapeutique. Une variété de cellule stable exprimant l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, par le biais de Grant Temático 2017/03489-1 à JK et de la bourse à FLB 2018/05350-3) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pour le financement de cette recherche. Nous tenons à remercier le Dr Adrian Krainer d’avoir fourni le plasmide pMTE1A et Zerler et ses collègues pour leur travail sur le clonage E1A. Nous remercions également le Prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti et prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller pour nous permettre d’utiliser leur espace de laboratoire et leur équipement.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
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