Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen
Summary
Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.
Abstract
Die mRNA-Verarbeitung umfasst mehrere gleichzeitige Schritte, um mRNA für die Translation vorzubereiten, wie z. B. 5’Capping, Poly-A-Addition und Spleißen. Neben dem konstitutiven Spleißen ermöglicht das alternative mRNA-Spleißen die Expression multifunktionaler Proteine aus einem Gen. Da Interkonomstudien in der Regel die erste Analyse für neue oder unbekannte Proteine sind, ist die Assoziation des Köderproteins mit Spleißfaktoren ein Hinweis darauf, dass es am mRNA-Spleißprozess teilnehmen kann, aber zu bestimmen, in welchem Kontext oder welche Gene reguliert werden, ist ein empirischer Prozess. Ein guter Ausgangspunkt, um diese Funktion zu evaluieren, ist die Verwendung des klassischen Minigene-Tools. Hier stellen wir die adenovirale E1A-Minigenverwendung zur Bewertung der alternativen Spleißveränderungen nach verschiedenen zellulären Stressreizen vor. Wir untersuchten das Spleißen von E1A-Minigen in HEK293, das das Nek4-Protein nach verschiedenen Stressbehandlungen stabil überexprimiert. Das Protokoll umfasst E1A-Minigentransfektion, Zellbehandlung, RNA-Extraktion und cDNA-Synthese, gefolgt von PCR- und Gelanalyse und Quantifizierung der E1A-Spleißvarianten. Der Einsatz dieser einfachen und etablierten Methode in Kombination mit spezifischen Behandlungen ist ein zuverlässiger Ausgangspunkt, um zelluläre Prozesse zu beleuchten oder welche Gene durch mRNA-Spleißen reguliert werden können.
Introduction
Das Spleißen gehört zu den wichtigsten Schritten in der eukaryotischen mRNA-Verarbeitung, die gleichzeitig mit dem 5’mRNA-Capping und der 3’mRNA-Polyadenylierung erfolgt, bestehend aus Intronentfernung gefolgt von Exon-Junction. Die Erkennung der Spleißstellen (SS) durch das Spleißosom, einen Ribonukleoproteinkomplex, der kleine Ribonukleoproteine (snRNP U1, U2, U4 und U6), kleine RNAs (snRNAs) und mehrere regulatorische Proteine1 enthält, ist für das Spleißen notwendig.
Neben der Intronentfernung (konstitutives Spleißen) können in Eukaryoten Introns zurückgehalten und Exons ausgeschlossen werden, wodurch der Prozess namens mRNA Alternatives Spleißen (AS) konfiguriert wird. Das alternative Pre-mRNA-Spleißen erweitert die Kodierungskapazität eukaryotischer Genome und ermöglicht die Produktion einer großen und vielfältigen Anzahl von Proteinen aus einer relativ kleinen Anzahl von Genen. Es wird geschätzt, dass 95-100% der menschlichen mRNAs, die mehr als ein Exon enthalten, einem alternativen Spleißenunterzogenwerden können2,3. Dies ist grundlegend für biologische Prozesse wie neuronale Entwicklung, Apoptose-Aktivierung und zelluläre Stressreaktion4, die dem Organismus Alternativen zur Regulierung der Zellfunktion mit dem gleichen Repertoire an Genen bieten.
Die für das alternative Spleißen erforderliche Maschine ist die gleiche, die für das konstitutive Spleißen verwendet wird, und die Verwendung des SS ist die Hauptdeterminante für das Auftreten alternativer Spleißen. Konstitutives Spleißen ist mit der Verwendung von starken Spleißstellen verbunden, die in der Regel Konsensmotiven für die Spleißosomerkennung ähnlicher sind5.
Alternative Exons werden typischerweise weniger effizient erkannt als konstitutive Exons, sobald ihre cis-regulatorischenElemente, die Sequenzen in 5’SS und 3’SS, die diese Exons flankieren, eine geringere Bindungskapazität an das Spleißosom aufweisen. mRNA enthält auch Regionen namens Enhancer oder Schalldämpfer, die sich in Exons (Exonic Splicing Enhancers (ESEs) und Exonic Splicing Silencers (ESSs)) und Introns (Intronic Splicing Enhancers (ISEs) und Intronic Splicing Silencers (ISSs)) befinden, die die Exonnutzung verbessern oder unterdrücken, bzw.5. Diese Sequenzen werden durch transregulatorische Elemente oder Spleißfaktoren (SF) erkannt. SFs werden hauptsächlich durch zwei Proteinfamilien repräsentiert, die Serin/Arginin-reichen Spleißfaktoren (SRSFs), die an ESEs binden, und die Familie der heterogenen nuklearen Ribonukleoproteine (hnRNPs), die an ESS-Sequenzen binden5.
Alternatives Spleißen kann durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Transfaktoren moduliert werden, wodurch die Interaktionspartner und die zelluläre Lokalisation der Spleißfaktoren6,7,8modifizieren. Die Identifizierung neuer Regulatoren von Spleißfaktoren kann neue Werkzeuge zur Regulierung des Spleißens und folglich einiger Krebsbehandlungen bieten.
Anufrieva et al. 9 beobachteten ineinemmRNA-Microarray-Genexpressionsprofil konsistente Veränderungen der Spiegel spleißosomaler Komponenten in 101 Zelllinien und nach verschiedenen Stressbedingungen (platinbasierte Medikamente, Gammabestrahlung, Topoisomerase-Inhibitoren, Tyrosinkinase-Inhibitoren und Taxane). Der Zusammenhang zwischen Spleißmuster und Chemotherapie-Wirksamkeit wurde bereits in Lungenkrebszellen nachgewiesen, die chemotherapieresistent sind und Veränderungen in der Caspase-9-Variantenrate10zeigen. HEK293-Zellen, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, zeigen Veränderungen beim Spleißen mit einer Zunahme pro-apoptotischer Varianten. Gabriel et al.11 beobachteten Veränderungen bei mindestens 700 Spleißereignissen nach Cisplatin-Behandlung in verschiedenen Zelllinien und weisen darauf hin, dass Spleißwege cisplatin-beeinflusst sind. Spleißmodulatoren haben bereits eine antitumorale Aktivität gezeigt und gezeigt, dass das Spleißen für die Tumorentwicklung und vor allem für das Ansprechen auf die Chemotherapie wichtig ist12. Daher ist die Charakterisierung neuer Proteine, die das Spleißen nach zellulären Stressoren wie Chemotherapeutika regulieren, sehr wichtig, um neue Behandlungsstrategien zu entdecken.
Die Hinweise auf alternative Spleißregulation aus Interaktomstudien, die besonders wichtig sind, um Funktionen neuer oder uncharakterisierter Proteine zu charakterisieren, können einen allgemeineren und einfacheren Ansatz erfordern, um die tatsächliche Rolle des Proteins bei AS zu überprüfen. Minigenes sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der allgemeinen Rolle eines Proteins, das die Spleißregulation beeinflusst. Sie enthalten Segmente aus einem interessierenden Gen, das alternativ gespleißte und flankierende genomische Regionen13enthält. Die Verwendung eines Minigen-Tools ermöglicht die Analyse des Spleißens in vivo mit mehreren Vorteilen, wie z. B. der Länge des Minigens, die geringfügig ist und daher keine Beschränkung auf die Amplifikationsreaktion darstellt; das gleiche Minigen kann in verschiedenen Zelllinien bewertet werden; alle zellulären Komponenten, hauptsächlich ihre regulierende post-translationale Modifikation (Phosphorylierung und Veränderungen in Zellkompartimenten) vorhanden sind und angesprochen werden können13,14. Darüber hinaus können Veränderungen des alternativen Spleißmusters nach zellulärem Stress beobachtet werden und die Verwendung eines Minigensystems ermöglicht es, den durch verschiedene Reize modulierten Signalweg zu identifizieren.
Es gibt bereits mehrere Minigensysteme, die spezifisch für verschiedene Arten von Spleißereignissensind 13,14,jedoch ist das Minigen E1A15 als vorläufiger Assay ein sehr gut etabliertes alternatives Spleiß-Reportersystem für die Untersuchung der 5’SS-Selektion in vivo. Aus nur einem Gen, E1A, werden fünf mRNAs durch alternatives Spleißen erzeugt, basierend auf der Auswahl von drei verschiedenen 5′ Spleißstellen und einer großen oder einer kleineren 3′ Spleißstelle16,17,18. Die Expression von E1A-Varianten ändert sich entsprechend der Periode der adenoviralen Infektion19,20.
Wir haben bereits gezeigt, dass beide Nek4-Isoformen mit Spleißfaktoren wie SRSF1 und hnRNPA1 interagieren, und während Isoform 2 das Minigen E1A alternative Spleißen ändert, hat Isoform 1 keine Wirkung in diesem21. Da Isoform 1 die am häufigsten vorkommende Isoform ist und die Chemotherapieresistenz und die DNA-Schadensreaktion verändert, bewerten wir, ob sie das alternative Spleißen des Minigens E1A in einem Stresszustand verändern könnte.
Der Minigene-Assay ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode, da er nur RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Amplifikation und Agarose-Gel-Analysen benötigt und ein nützliches Werkzeug sein kann, um eine mögliche Wirkung auf das alternative Spleißen durch ein Protein von Interesse bis zur Wirkung verschiedener Behandlungen auf das zelluläre alternative Spleißmuster zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigenes sind wichtige Werkzeuge, um die Auswirkungen beim globalen alternativen Spleißen in vivo zu bestimmen. Das adenovirale Minigen E1A wird seit Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um die Rolle von Proteinen zu bewerten, indem die Menge dieser in der Zelle erhöht wird13,14. Hier schlagen wir das Minigen E1A zur Bewertung des alternativen Spleißens nach chemotherapeutischer Exposition vor. Es wurde eine stabile Zelllinie verwendet, die die Nek4-Isoform 1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, durch Grant Temático 2017/03489-1 an JK und Stipendium an FLB 2018/05350-3) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Adrian Krainer für die Bereitstellung des pMTE1A-Plasmids und Zerler und Kollegen für ihre Arbeit im E1A-Klonen. Wir danken auch Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti und Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller, die uns die Nutzung ihrer Laborräume und -geräte ermöglichen.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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