यह प्रोटोकॉल कीमोथैरेपी उपचार के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन में अस्वाभाविक कार्य के साथ प्रोटीन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से और उपयोगी उपकरण प्रस्तुत करता है।
एमआरएनए प्रसंस्करण में अनुवाद के लिए एमआरएनए तैयार करने के लिए कई एक साथ कदम शामिल हैं, जैसे कि 5’कैपिंग, पॉली-ए अतिरिक्त और स्प्लिसिंग। संविलियन स्प्लिसिंग के अलावा, वैकल्पिक एमआरएनए स्प्लिसिंग एक जीन से बहुआयामी प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। चूंकि इंटरैक्टोम अध्ययन आम तौर पर नए या अज्ञात प्रोटीन के लिए पहला विश्लेषण होता है, इसलिए स्प्लिसिंग कारकों के साथ चारा प्रोटीन का संबंध एक संकेत है कि यह एमआरएनए स्प्लिसिंग प्रक्रिया में भाग ले सकता है, लेकिन यह निर्धारित करने के लिए कि किस संदर्भ में या जीन को विनियमित किया जाता है, एक अनुभवजन्य प्रक्रिया है। इस फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु शास्त्रीय मिनीजीन उपकरण का उपयोग कर रहा है। यहां हम विभिन्न सेलुलर तनाव उत्तेजनाओं के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एडेनोवायरल E1A मिनीजीन उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमने विभिन्न तनाव वाले उपचारों के बाद नेक 4 प्रोटीन को स्थिर रूप से HEK293 में E1A मिनीजीन के स्प्लिसिंग का मूल्यांकन किया। प्रोटोकॉल में E1A मिनीजीन ट्रांसफैक्शन, सेल ट्रीटमेंट, आरएनए एक्सट्रेक्शन और सीडीएनए संश्लेषण शामिल हैं, जिसके बाद पीसीआर और जेल विश्लेषण और E1A स्प्लिट वेरिएंट का परिमाणीकरण शामिल है। विशिष्ट उपचारों के साथ संयुक्त इस सरल और अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालने के लिए एक विश्वसनीय प्रारंभिक बिंदु है या क्या जीन को एमआरएनए स्प्लिसिंग द्वारा विनियमित किया जा सकता है।
स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक एमआरएनए प्रसंस्करण में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है जो एक साथ 5’mRNA कैपिंग और 3’mRNA पॉलीडेनिलेशन होता है, जिसमें एक्सॉन जंक्शन के बाद इंट्रोन हटाने शामिल हैं। स्प्लिसियोसोम द्वारा स्प्लिस साइटों (एसएस) की मान्यता, छोटे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (snRNP U1, U2, U4 और U6), छोटे आरएनए (snRNAs) और कई नियामक प्रोटीन1 युक्त एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक है।
यूकेरियोट्स में इंट्रॉन हटाने (संविलियन स्प्लिसिंग) के अलावा, इंट्रोन को बनाए रखा जा सकता है और एक्सॉन को बाहर रखा जा सकता है, इस प्रक्रिया को एमआरएनए वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) कहा जाता है। वैकल्पिक प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक जीनोम की कोडिंग क्षमता का विस्तार करता है जिससे अपेक्षाकृत कम संख्या में जीन से बड़ी और विविध संख्या में प्रोटीन का उत्पादन होता है। यह अनुमान लगाया गया है कि 95-100% मानव 100% जिनमें एक से अधिक एक्सोन होते हैं,वैकल्पिक स्प्लिसिंग2,3से गुजर सकते हैं। यह न्यूरोनल डेवलपमेंट, एपोप्टोसिस एक्टिवेशन और सेलुलर स्ट्रेस रिस्पांस4जैसी जैविक प्रक्रियाओं के लिए मौलिक है, जो जीन के एक ही प्रदर्शनों की सूची का उपयोग करके कोशिका कार्य को विनियमित करने के लिए जीव विकल्प प्रदान करता है।
वैकल्पिक स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक मशीनरी का उपयोग संविलियन स्प्लिसिंग के लिए किया जाता है और एसएस का उपयोग वैकल्पिक स्प्लिसिंग घटना के लिए मुख्य निर्धारक है। संविलियन स्प्लिसिंग मजबूत स्प्लिसिंग साइटों के उपयोग से संबंधित है, जो आमतौर पर स्प्लिकोसोम मान्यता5के लिए आम सहमति रूपांकनों के समान होते हैं।
वैकल्पिक एक्सोन्स को आम तौर पर अपने सीआईएस-नियामकतत्वों के संविलियन एक्सन की तुलना में कम कुशलता से पहचाना जाता है, 5’SS और 3’SS में दृश्य इन एक्सॉन को फ्लैंक करते हैं, स्प्लिकोसोम के लिए एक अवर बाध्यकारी क्षमता दिखाते हैं। एमआरएनए में एक्सॉन्स (एक्सोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (ईएसएस) और एक्सोनिक स्प्लिसिंग साइलेंसर (ईएसएस)) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (आईएसईएस) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्लाइजर (आईएसएस) में स्थित एन्हांसर्स या साइलेंसर नाम के क्षेत्र भी शामिल हैं, जो क्रमशः5,विस्तार के उपयोग को बढ़ाते हैं या दमन करते हैं। इन दृश्यों को ट्रांस-नियामक तत्वों, या स्प्लिसिंग कारकों (एसएफ) द्वारा पहचाना जाता है। एसएफएस का प्रतिनिधित्व मुख्य रूप से प्रोटीन के दो परिवारों द्वारा किया जाता है, सेरीन/आर्जिनिन रिच स्प्लिसिंग फैक्टर्स (एसआरएफएस) जो ईएसएस और विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (एचएनआरआरपी) के परिवार को बांधते हैं जो ईएसएस दृश्यों5से बांधते हैं ।
वैकल्पिक स्प्लिसिंग को ट्रांस-कारकों के फॉस्फोरिलेशन/डीफोस्फोरिलेशन द्वारा संग्राहक किया जा सकता है जो इंटरैक्शन भागीदारों को संशोधित करता है और स्प्लिसिंग कारकों के सेलुलर स्थानीयकरण6,7,8। स्प्लिसिंग कारकों के नए नियामकों की पहचान करने से स्प्लिसिंग को विनियमित करने के लिए नए उपकरण प्रदान किए जा सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप, कुछ कैंसर उपचार।
एक एमआरएनए माइक्रोएरे जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में अनुफ्रीवा एट अल9,101 सेल लाइनों में स्प्लिकोसोमोमल घटकों के स्तर में लगातार परिवर्तन और विभिन्न तनाव स्थितियों (प्लेटिनम आधारित दवाओं, गामा विकिरण, टोपोसोमरैरेस अवरोधकों, टायरोसिन किनेज़ अवरोधकों और टैक्सेन) के बाद मनाया गया। स्प्लिसिंग पैटर्न और कीमोथेरेपी प्रभावकारिता के बीच संबंध पहले से ही फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है, जो कीमोथेरेपी प्रतिरोधी हैं, कैस्पा-9 वेरिएंट दर10में परिवर्तन दिखा । कीमोथैरेपी पैनल के साथ इलाज की कोशिकाओं प्रो-एपोटोटिक वेरिएंट में वृद्धि के साथ स्प्लिसिंग में परिवर्तन दिखाते हैं। गेब्रियल एटअल. 11 ने विभिन्न सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन उपचार के बाद स्प्लिसिंग की कम से कम 700 घटनाओं में परिवर्तन देखा, यह इंगित करता है कि स्प्लिसिंग रास्ते सिस्प्लैटिन-प्रभावित हैं। स्प्लिसिंग मॉड्यूलर ने पहले ही एंटी-ट्यूमरल गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि स्प्लिसिंग ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है और मुख्य रूप से कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया12। इसलिए, नए प्रोटीन की विशेषता है जो कीमोथेरेपी जैसे सेलुलर स्ट्रेसर्स एजेंटों के बाद स्प्लिसिंग को विनियमित करते हैं, उपचार की नई रणनीतियों की खोज करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
इंटरैक्टोम अध्ययनों से वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन के सुराग, विशेष रूप से नए या अस्वाभाविक प्रोटीन के कार्यों की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण, एएस में प्रोटीन की वास्तविक भूमिका को सत्यापित करने के लिए अधिक सामान्य और सरल दृष्टिकोण की मांग कर सकते हैं। मिनीजीन स्प्लिसिंग विनियमन को प्रभावित करने वाले प्रोटीन की सामान्य भूमिका के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इनमें रुचि के जीन से लेकर वैकल्पिक रूप से कटा हुआ और जीनोमिक क्षेत्रों में13से अधिक के खंड होते हैं . एक मिनीजीन उपकरण का उपयोग करने से वीवो में स्प्लिसिंग के विश्लेषण की अनुमति मिलती है, जैसे कि मिनीजीन की लंबाई जो मामूली है और इसलिए प्रवर्धन प्रतिक्रिया की सीमा नहीं है; एक ही मिनीजीन का मूल्यांकन विभिन्न सेल लाइनों में किया जा सकता है; सभी सेलुलर घटक, मुख्य रूप से उनके विनियमन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (फॉस्फोरिलेशन और सेल डिब्बों में परिवर्तन) मौजूद हैं और13,14को संबोधित किया जा सकता है . इसके अलावा, सेलुलर तनाव के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न में परिवर्तन देखा जा सकता है और, एक मिनीजीन प्रणाली का उपयोग, विभिन्न उत्तेजनाओं द्वारा संग्राहक किए जा रहे मार्ग की पहचान करने की अनुमति देता है।
पहले से ही वर्णित कई मिनीजीन प्रणालियां हैं जो विभिन्न प्रकार की स्प्लिसिंग घटनाओं के लिए विशिष्ट हैं13,14,हालांकि, प्रारंभिक परख के रूप में, मिनीजीन ई1ए 15 वीवो में 5 के एसएस चयन के अध्ययन के लिए एक बहुत अच्छी तरह से स्थापित वैकल्पिक स्प्लिसिंग रिपोर्टर सिस्टम है। केवल एक जीन, E1A, पांच mRNAs से तीन अलग-अलग 5 ‘स्प्लिस साइटों और एक प्रमुख या एक छोटे से 3’ स्प्लिस साइट16, 17, 18के चयन के आधार पर वैकल्पिक स्प्लिसिंग द्वारा उत्पादित कियाजाताहै। ई 1ए वेरिएंट की अभिव्यक्ति एडेनोवायरल संक्रमण19,20की अवधि के अनुसार बदलती है ।
हमने पहले दिखाया है कि दोनों Nek4 आइसोफॉर्म SRSF1 और hnRNPA1 जैसे स्प्लिसिंग कारकों के साथ बातचीत करते हैं और जबकि आइसोफॉर्म 2 परिवर्तन मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग, आइसोफॉर्म 1 का उस21में कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। क्योंकि आइसोफॉर्म 1 सबसे प्रचुर मात्रा में आइसोफॉर्म है और कीमोथेरेपी प्रतिरोध और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में परिवर्तन करता है, हम मूल्यांकन करते हैं कि क्या यह तनाव की स्थिति में मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग बदल सकता है।
मिनीजीन परख एक सरल, कम लागत और तेजी से विधि है, क्योंकि यह केवल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, प्रवर्धन और agarose जेल विश्लेषण की जरूरत है, और सेलुलर वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव तक हितों के प्रोटीन द्वारा वैकल्पिक स्प्लिसिंग पर संभावित प्रभाव के बाद से मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
वीवो में वैश्विक वैकल्पिक स्प्लिसिंग में प्रभाव निर्धारित करने के लिए मिनीजीन महत्वपूर्ण उपकरण हैं। एडेनोवायरल मिनीजीन ई 1ए का उपयोग दशकों से कोशिका13,14में इनकी मात्रा में वृद्?…
The authors have nothing to disclose.
हम फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईपी, धन्यवाद देते हैं, इस शोध के वित्तपोषण के लिए ग्रांट टेमेटिको 2017/03489-1 के माध्यम से जेके और फैलोशिप को एफएलबी 2018/05350-3) और कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेवोल्विमेंटो सिएंटिको ई टेकनोलोजिको (सीएनपीक्यू) के माध्यम से। हम E1A क्लोनिंग में अपने काम के लिए pMTE1A प्लाज्मिड और Zerler और सहयोगियों को उपलब्ध कराने के लिए डॉ एड्रियन Krainer शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रो डॉ पैट्रसिया मोरिएल, प्रो डॉ वांडा परेरा अलमेडा, प्रो डॉ मार्सेलो लांसलोट्टी और प्रो डॉ करीना कोगो कोगो मुलर को भी धन्यवाद देते हैं ताकि हमें उनकी प्रयोगशाला अंतरिक्ष और उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति दी जा सके ।
100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
Agarose | Sigma | A9539-250G | |
Cisplatin | Sigma | P4394 | |
DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
Trypsin | Sigma | T4799 |