Summary
이 기사에서는 두개안면 발달 중 기저 전뇌의 신호 전달 및 패턴 특성을 테스트하도록 설계된 조직 이식 기술에 대해 설명합니다.
Abstract
조류 배아는 100년 이상 모델 시스템으로 사용되어 왔으며 척추동물 발달에 대한 근본적인 이해로 이어졌습니다. 이 모델 시스템의 강점 중 하나는 키메라 배아에서 조직의 효과와 상호 작용을 직접 평가할 수 있다는 것입니다. 우리는 이전에 전뇌의 신호가 전두엽 외배엽 영역(FEZ)에서 소닉 고슴도치(SHH)의 발현 도메인 모양을 조절하여 안면 형태 형성에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 기사에서는 전뇌 키메라를 생성하는 방법을 설명하고 이러한 실험 결과를 설명합니다.
Introduction
발달 생물학에 대한 많은 현대 연구는 배아를 형성하는 유전자의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 유전적 관점에서 발달 메커니즘을 조사할 수 있는 좋은 도구가 있습니다. 그러나 배아는 조립되어 조직 상호 작용에 반응하여 형태 형성을 겪습니다. 조류 시스템은 다음과 같은 이유로 발달을 조절하는 다양한 조직 상호 작용을 평가하는 데 사용되는 고전적인 도구입니다 : 발생학은 잘 이해되고, 배아는 쉽게 접근 할 수 있으며, 조류 시스템 분석 도구는 잘 발달되어 있으며, 배아는 저렴합니다.
조류 이식 시스템은 거의 한 세기 동안 혈통 추적 및 발달 중 조직 상호 작용을 평가하는 데 널리 사용되었습니다 1,2,3,4. 이 시스템은 위턱의 형태 형성을 조절하는 신호 센터인 전두엽 외배엽 영역(Frontonasal Ectodermal Zone, FEZ)을 조사하는 데 사용되었으며, 이전에 6. 메추라기 병아리 외에도 다른 종들도 조직 상호 작용 분석을 위해 키메라를 생산하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 마우스 FEZ는 야생형7 및 돌연변이 마우스8로부터 이식되었고, 다른 사람들은 오리, 메추라기 및 병아리 시스템을 사용하여 안면 골격 9,10,11,12을 패턴화하는 데 신경 능선의 역할을 평가했습니다.
본 연구에서는 FEZ에서 소닉 고슴도치 발현을 유도하기 위해서는 전뇌의 신호가 필요하기 때문에 복부 전뇌를 메추라기, 오리, 병아리 배아에 상호 이식하여 FEZ에서 유전자 발현 패턴을 조절하는 전뇌의 역할을 평가하였다. 전뇌 이식은 이 분야에서만 볼 수 있는 것이 아닙니다. 이 이식은 메추라기와 오리 배아의 운동성 발달을 평가하는 데 사용되었지만13, 이 실험에서는 비신경 유도체에 기여한 조직도 이식되었다. 다른 연구에서, 조류의 청각 회로는 전뇌 이식(forebrain transplantation)에 의해 평가되었지만, 이러한 이식은 얼굴 모양(9,10)에 기여하고FEZ15에서 SHH 발현 조절에 관여하는 추정 신경 능선 세포를 포함했다. 따라서, 신경관을 폐쇄하기 전에 한 종의 새에서 다른 종으로 복부 전뇌만을 이식하는 시스템이 얼굴 모양에서 뇌의 역할을 평가하기 위해 고안되었습니다(그림 1A, B). 이 방법은 이식편의 신경 능선 오염이 없었습니다. 이 기사에서는 방법을 설명하고 예상 결과를 설명하며 직면한 과제에 대해 설명합니다.
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Protocol
흰 북경 오리 (Anas platyrhynchos), 흰 레그혼 닭 (Gallus gallus) 및 일본 메추라기 (Cortunix coturnix japonica)는 HH7 / 8에서 단계 일치 할 때까지 가습 된 챔버에서 37 ° C에서 배양됩니다17.
1. 기증자 조직 준비
참고: 시약 및 도구의 준비와 실험 조작을 위해 계란을 여는 방법이 설명되었습니다6.
- 중성 적색, 유리 전사 피펫 및 날카롭게 연마된 텅스텐 바늘로 DMEM 배지를 준비합니다.
- 배아를 노출시킵니다(6 참조).
- 7/8기 배아의 기저 전뇌 왼쪽에서 조직 이식편을 채취합니다. 구부러진 뾰족한 텅스텐 바늘6 을 사용하여 길이 ~ 0.3mm, 너비 0.2mm 크기의 전뇌 조각을 부드럽게 절개하고 바늘을 전뇌 아래로 밀어 밑에있는 내배엽을 포함하지 않도록하여 바늘이 신경관의 축과 평행이되도록합니다.
- 유리 전사 피펫을 사용하여 기증자 배아에서 이식편을 채취합니다.
- 이식편을 Neutral Red(PBS 중 0.01%, 23°C)가 포함된 DMEM에 2분 동안 옮겨 염색한 후 염색된 이식편을 생착 준비가 될 때까지 Neutral Red가 포함되지 않은 DMEM에 넣습니다.
2. 호스트 준비
- 흰 레그혼 닭(Gallus gallus)의 수정란을 37°C의 가습실에서 HH7/8까지 배양한다 17.
- 배아를 노출시킵니다(6 참조).
- 뾰족한 텅스텐 바늘을 사용하여 부드럽게 절단하여 이식편 부위를 준비한 다음 기증자 조직을 분리하기 위해 이식편을 수용하기 위해 왼쪽에서 0.3mm x 0.2mm 기저 전뇌 조각을 제거합니다.
- 밑에 있는 내배엽이 과도하게 파괴되지 않도록 주의해야 하며, 이는 난황 과립이 찢어진 부분을 통해 누출되기 시작할 때 분명합니다. 이것은 연습이 필요하며 모든 시도가 성공하는 것은 아닙니다.
- 숙주(6)로 옮긴 후, 숙주의 절제된 기저 전뇌를 대체하기 위해 이식편을 위치시킨다.
- 구멍 위에 테이프를 단단히 붙이고 분석을 위해 적절한 시간 동안 배아를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
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Representative Results
키메라와 이식 오염의 평가
키메라를 평가하기 위해서는 키메라의 정도와 다른 세포 유형에 의한 이식편의 오염 정도를 다루어야 합니다. 메추라기 조직을 병아리 배아에 이식하여 키메라를 만들면 이러한 유형의 분석이 가능합니다. QCPN 항체를 사용하여 메추라기 세포를 시각화하고 숙주 조직과 구별할 수 있습니다(그림 1, C, D). 이 경우, 복부 전뇌에서 유래한 조직만이 이식편이 신경 능선을 포함한 다른 세포 유형으로 오염되지 않았음을 나타내는 항체로 염색되었습니다. 키메라증의 정도는 숙주 및 기증자 세포를 계산하기 위해 입체학을 사용하거나 기증자 및 숙주 조직이 차지하는 영역을 평가함으로써 이러한 섹션에서 추정할 수 있습니다.
형태학적 및 분자적 결과의 평가
목표는 FEZ에서 안면 형태 및 SHH 발현에 대한 복부 전뇌의 영향을 평가하는 것이었습니다. 초기에, 상기 기술된 바와 같이 키메라증을 평가하기 위해 QCPN을 사용하기 위해 메추라기 조직을 오리 배아에 이식하였다. 그러나 더 빨리 발달하는 메추라기 뇌는 심하게 변형된 키메라로 이어졌고(그림 2), 이는 실험에서 이러한 접근 방식을 배제했습니다. 이러한 한계로 인해 오리 조직을 닭 배아에 이식하는 것이 실험 분석에 사용되었습니다. 이것은 키메라의 평가를 허용하지 않았지만, 이를 위해 메추라기 병아리 시스템을 사용했고 모든 이식편이 신경 조직으로만 구성되어 있음을 확인했다16. 그 결과 오리-병아리 키메라는 뇌가 형태 조절에 참여했음을 시사하는 형태학적 변화를 보였습니다(그림 3). 이식의 오리 쪽은 더 느리게 발달하는 것처럼 보였고 더 오리처럼 보였습니다. 이러한 키메라가 오리 형태로 이동했는지 확인하기 위해 정량적 분석이 사용되었습니다16. 대조군 단계로 오리와 병아리 배아와 병아리 키메라가 사용되었습니다.
SHH 발현을 평가하기 위해 전체 마운트 계내 하이브리드화를 사용하였다. 형태학과 유사하게, 키메라의 오리 쪽에서 SHH 발현은 더 오리처럼 보였다(그림 3). 정량적 분석(18)은 또한 이 발현 도메인이 머리 형상(16)과 상관관계가 있음을 보여주기 위해 사용되었다.
그림 1. 실험 배아에서 키메라의 이식 및 평가
(A) 이식편 및 생착 부위의 위치를 보여주는 중성 빨간색으로 염색된 8기 닭 배아의 등쪽 모습. 점선은 SHH 발현을 보여주기 위해 제자리내 혼성화 후 단계 8 닭 배아를 통해 단면 B. (B)에 나타낸 대략적인 수준이다. 이식편의 대략적인 위치는 빨간색 점선 상자로 표시됩니다. (C) 메추라기-병아리 키메라에서 QCPN을 검출하기 위한 면역염색은 이식편이 널리 퍼져 있고 복측-측면 신경관(화살) 및 복부 시신경컵(화살촉)에만 기여한다는 것을 보여준다. (D) C. 스케일 바의 더 높은 배율: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 메추라기 오리 키메라의 형태 평가.
(ᄀ, ᄂ) 22 단계에서 메추라기 오리 키메라의 두 가지 예. 이 배아에는 추가 분석이 불가능한 심각한 기형이 있습니다. 스케일 바: 2mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 오리 병아리 키메라 평가.
(A) SHH 발현을 시각화하기 위해 전체 마운트 in situ 하이브리드화 후 22단계에서 정상 병아리 및 (B) 오리 배아. (C) 병아리-병아리 대조군은 정상 병아리 배아와 유사한 SHH 및 형태의 패턴을 보여줍니다. (D) 오리-병아리 키메라는 SHH 발현의 변경된 패턴을 보여줍니다. 이식 된 쪽에서 SHH 발현 (노란색 점선)은 더 둥글고 오리 패턴과 유사합니다. 비강 구덩이는 또한 숙주 쪽(빨간색 화살표)의 "슬릿"과 같은 모양에 비해 이식된 쪽(노란색 화살표)이 더 둥글다. 빨간색 막대는 정중선을 나타내고 이식은 이미지의 오른쪽에 있습니다. 스케일 바: 1mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명 된 방법은 기저 전뇌와 인접한 외배엽 사이의 조직 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 이 접근법은 기증자 조직이 복부 전뇌로 제한되었기 때문에 이전의 전뇌 이식 방법과 다릅니다. 이것은 얼굴 형태 9,10을 패턴화하는 데 참여하는 것으로 밝혀진 신경 능선 세포의 이식을 제거합니다. 따라서 이식편을 기저 전뇌로 제한하는 것은 계획된 실험 결과를 평가하는 데 필수적이었습니다.
전뇌 이식13,14을 사용한 이전 연구에서 신경 외 조직의 존재는 결과가 행동적이거나 전반적인 뇌 발달에 대한 숙주 및 기증자 환경을 구체적으로 테스트했기 때문에 계획된 결과 측정의 해석을 방해하지 않았습니다. 이것은 이러한 발생학적 접근 방식을 사용하여 실험을 설계할 때 중요한 고려 사항이며 타당성은 엄격함과 균형을 이루어야 합니다. 예를 들어, 추정 신경 능선 세포를 제외하라는 요구 사항은 극복해야 할 중요한 장애물을 만들었습니다. 이식은 초기 신경세포 단계 배아에서 수행되어야 했습니다. 이 단계에서 내배엽은 이식 부위에 바로 인접 해 있으며, 내배엽이 손상되지 않도록 각별한주의를 기울여야합니다. 내배엽에 의한 이식편의 오염이 결과 측정에 영향을 미칠지는 확실하지 않지만 목표는 복부 전뇌가 안면 발달에 미치는 영향을 독점적으로 분리하는 것이었습니다. 따라서 이를 위해 추가적인 엄격함이 보장되었습니다.
숙주와 기증자 종의 발달 속도를 고려해야 합니다. 이들 동물의 비율의 차이는 발달 중인 안면 골격을 패턴화하는 데 있어서 신경 능선 세포의 역할을 평가하는 데 유리하게 사용되어 왔지만(19,20), 이 경우, 더 빨리 발달하는 메추라기 신경 조직은 느리게 발달하는 오리에게 이식될 때 극도로 기형적인 배아를 생성하였다. 이것은 메추라기 조직을 병아리 숙주에 이식하여 만든 또 다른 키메라 세트에서 키메라와 오염을 평가해야 함을 의미했으며 이상적이지는 않지만 이식 기술에 대한 확신을 제공했습니다.
전반적으로, 발달 중 조직 상호 작용을 평가하기 위해 키메라를 만드는 것은 발달 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되는 강력한 접근 방식이 될 수 있습니다. 결과가 가능한 한 결정적일 수 있도록 계획 단계에서 주의를 기울여야 하며, 수술로 인한 변이를 설명하기 위해 정상 배아 및 기타 키메라를 포함하는 적절한 통제가 결정되어야 합니다. 이 경우 관찰 된 변화가 미묘하기 때문에 정량적 분석을 사용하는 것이 매우 중요했습니다.
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Disclosures
모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R01DE019648, R01DE018234 및 R01DE019638로 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 치과 및 두개안면 연구 연구소(National Institute of Dental and Craniofacial Research)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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