Productie van membraangefilterde faseverschuivingsdecafluorbutaan nanodruppels uit voorgevormde microbubbels
Summary
Dit protocol beschrijft een methode om grote hoeveelheden lipide ingekapselde decafluorbutaan microbubbels te genereren met behulp van sonde-tip sonicatie en ze vervolgens te condenseren tot faseverschuiving nanodruppels met behulp van hogedruk extrusie en mechanische filtratie.
Abstract
Er zijn veel methoden die kunnen worden gebruikt voor de productie van verdampbare faseverschuivingsdruppels voor beeldvorming en therapie. Elke methode maakt gebruik van verschillende technieken en varieert in prijs, materialen en doel. Veel van deze fabricagemethoden resulteren in polydisperse populaties met niet-uniforme activeringsdrempels. Bovendien vereist het regelen van de druppelgroottes doorgaans stabiele perfluorkoolstofvloeistoffen met hoge activeringsdrempels die in vivo niet praktisch zijn. Het produceren van uniforme druppelgroottes met behulp van gassen met een laag kookpunt zou gunstig zijn voor in vivo beeldvormings- en therapie-experimenten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en economische methode voor de vorming van grootte-gefilterde lipide-gestabiliseerde faseverschuiving nanodruppels met laag kookpunt decafluorbutaan (DFB). Een veelgebruikte methode voor het genereren van lipide microbubbels wordt beschreven, naast een nieuwe methode om ze in één stap te condenseren met hogedrukextrusie. Deze methode is ontworpen om tijd te besparen, de efficiëntie te maximaliseren en grotere volumes microbubbel- en nanodruppeloplossingen te genereren voor een breed scala aan toepassingen met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur die in veel biologische laboratoria wordt aangetroffen.
Introduction
Ultrasone contrastmiddelen (UCA’s) groeien snel in populariteit voor beeldvormings- en therapietoepassingen. Microbubbels, de oorspronkelijke UCA’s, zijn momenteel de reguliere middelen die worden gebruikt in klinische diagnostische toepassingen. Microbubbels zijn met gas gevulde bolletjes, meestal 1-10 μm in diameter, omgeven door lipide-, eiwit- of polymeerschillen1. Hun grootte en in vivo stabiliteit kunnen hun functionaliteit in veel toepassingen echter beperken. Faseverschuiving nanodruppels, die een oververhitte vloeibare kern bevatten, kunnen enkele van deze beperkingen overwinnen vanwege hun kleinere formaat en verbeterde levensduur2. Bij blootstelling aan warmte of akoestische energie verdampt de oververhitte vloeibare kern tot een gasmicrobubbel2,3,4,5. Aangezien de verdampingsdrempel direct verband houdt met de druppelgrootte5,6, zou het formuleren van druppelsuspensies met uniforme grootte zeer wenselijk zijn voor het bereiken van consistente activeringsdrempels. Formuleringsmethoden die uniforme druppelgroottes produceren zijn vaak complex en kostbaar, terwijl meer kosteneffectieve benaderingen resulteren in polydisperse-oplossingen7. Een andere beperking is het vermogen om stabiele faseverschuivingsdruppels te genereren met perfluorkoolstofgassen (PFC) met een laag kookpunt, wat van cruciaal belang is voor efficiënte activering in vivo8. In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het genereren van stabiele gefilterde laagkokende verdampingsdruppels met laag kookpunt voor in vivo beeldvormings- en therapietoepassingen.
Er zijn veel methoden om monodispersed submicron faseverschuivingsdruppels7 te produceren. Een van de meest robuuste methoden om de grootte te regelen, is het gebruik van microfluïdische apparaten. Deze apparaten kunnen duur zijn, hebben een trage druppelproductie (~ 104-106 druppels / s)7 en vereisen uitgebreide training. Microfluïdische apparaten vereisen over het algemeen ook gassen met een hoog kookpunt om spontane verdamping en verstopping van het systeem te voorkomen7. Een recente studie van de Gracia Lux et al.9 toont echter aan hoe het koelen van een microfluidizer kan worden gebruikt om hoge concentraties submicron faseverschuiving (1010-1012 / ml) te genereren met behulp van decafluobutaan met laag kookpunt (DFB) of octafluorpropaan (OFP).
Over het algemeen zijn gassen met een laag kookpunt, zoals DFB of OFP, gemakkelijker te hanteren met behulp van voorgevormde gasbellen. Verdampbare druppels kunnen worden geproduceerd uit voorloper lipide-gestabiliseerde bellen door het gas te condenseren met behulp van lage temperaturen en verhoogde druk5,10. De concentratie van druppels die met deze methode worden geproduceerd, hangt af van de concentratie van voorlopermicrobubbels en de efficiëntie van de omzetting van bellen in druppels. Geconcentreerde microbubbels zijn gemeld van tip sonicatie die > 1010 MB / ml11 nadert, terwijl een afzonderlijke studie druppelconcentraties heeft gemeld variërend van ~ 1-3 x1011 druppels / ml van gecondenseerde OFP- en DFP-bubbels12. Wanneer monodispersed druppels geen probleem zijn, zijn condensatiemethoden de meest eenvoudige en goedkoopste methoden voor het genereren van lipide-gestabiliseerde faseverschuivingsdruppels met behulp van PFK’s met een laag kookpunt. Methoden voor het genereren van bubbels van uniforme grootte voordat ze condenseren, kunnen helpen bij het creëren van meer monodisperse populaties van druppels. Het genereren van monodisperse precursorbellen is echter ook moeilijk, waardoor duurdere benaderingen zoals microfluïdica of herhaalde differentiële centrifugatietechnieken11 nodig zijn. Een alternatieve benadering voor de productie van DFB- en OFB-nanodruppels is onlangs gepubliceerd met behulp van spontane nucleatie van druppels in liposomen13. Deze methode, met behulp van een “Ouzo” -effect, is een eenvoudige manier om PFC-druppels met een laag kookpunt te genereren zonder bubbels te hoeven condenseren. De grootteverdeling van de PFC-druppels kan worden geregeld door delicate titratie en menging van PFC-, lipide- en ethanolcomponenten die worden gebruikt om de nucleatie van de druppels te initiëren. Het is ook vermeldenswaard dat het mengen van perfluorkoolwaterstoffen kan worden gebruikt om de stabiliteit en activeringsdrempels van nanodruppels14,15 te regelen. Meer recent werk van Shakya et al. toont aan hoe nanodruppelactivering kan worden afgestemd door PFK’s met een hoog kookpunt in een koolwaterstof-endoskeleton te emuleren om heterogene nucleatie in de druppelkern16 te vergemakkelijken, wat een benadering is die kan worden overwogen samen met andere vormen van druppelgroottefiltratie.
Eenmaal gevormd, kunnen faseverschuivingdruppels na vorming worden geëxtrudeerd om meer monodisperse populaties te creëren. In feite is een soortgelijk protocol met de hier beschreven methode eerder gepubliceerd door Kopechek et al.17 met behulp van dodecofluorpentane (DDFP) met hoog kookpunt als druppelkern. Lezers die faseverschuivingsdruppels met perfluorkoolwaterstoffen met hoog kookpunt (stabiel bij kamertemperatuur) willen gebruiken, moeten in plaats daarvan het bovenstaande artikel raadplegen. Het genereren en extruderen van druppels met gassen met een laag kookpunt, zoals DFB en OFP, is ingewikkelder en kan het beste worden benaderd door voorgevormde gasbellen te condenseren.
In dit protocol wordt een veelgebruikte methode beschreven voor het genereren van voorgevormde lipidemicrobubbels met een DFB-gaskern met behulp van sondetipsoonapparaat. Vervolgens wordt een commerciële extruder gebruikt om voorgevormde microbubbels te condenseren tot submicron faseverschuiving nanodruppeltjes (figuur 1). De resulterende druppels zijn dan te activeren door warmte en echografie. Deze methode kan grotere volumes nanodruppeloplossing produceren dan conventionele condensatiemethoden met smallere grootteverdelingen zonder de noodzaak van dure microfluïdische apparaten. De productie van nanodruppeloplossingen met smalle grootteverdelingen kan waarschijnlijk meer uniforme verdampingsdrempels genereren. Dit zal hun potentieel maximaliseren voor tal van toepassingen zoals beeldvorming, ablatie, medicijnafgifte en embolisatie1,3,4,6.
Figuur 1: Schema van hogedrukextrusie-opstelling voor het condenseren van voorgevormde microbubbels in faseverschuivingsnanodruppels. Microbubbeloplossing wordt toegevoegd aan en opgenomen in de extruderkamer en 250 psi, uit de stikstoftank, wordt aangebracht door de kamerinlaatklep. Het stikstofgas duwt de microbubbeloplossing door het filter aan de basis van de kamer en condenseert het monster tot nanodruppels. De oplossing wordt uiteindelijk door de monsteruitlaatbuis uit de extruder geduwd en verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is een uitgebreide hoeveelheid literatuur beschikbaar die de formulering, fysica en mogelijke toepassingen van microbubbels en faseverschuivingdruppels voor in vivo beeldvorming en therapie bespreekt. Deze discussie heeft expliciet betrekking op het genereren van lipide microbubbels en deze om te zetten in sub-micron faseverschuivingsdruppels met behulp van een DFB-gas met laag kookpunt en hogedrukextrusie. De hier beschreven methode is bedoeld om een relatief eenvoudige methode te bieden voor het produceren van grote…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dominique James in het laboratorium van Dr. Ken Hoyt bedanken voor het leveren van TRSP-analyse van verdampbare faseverschuiving nanodruppels
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
