Producción de nanogotas de decafluorobutano de cambio de fase filtradas por membrana a partir de microburbujas preformadas

Summary

Este protocolo describe un método para generar grandes volúmenes de microburbujas de decafluorobutano encapsuladas en lípidos utilizando sonicación de punta de sonda y posteriormente condensarlos en nanogotas de cambio de fase utilizando extrusión de alta presión y filtración mecánica.

Abstract

Hay muchos métodos que se pueden utilizar para la producción de gotas vaporizables de cambio de fase para imágenes y terapia. Cada método utiliza diferentes técnicas y varía en precio, materiales y propósito. Muchos de estos métodos de fabricación dan como resultado poblaciones polidispersas con umbrales de activación no uniformes. Además, el control de los tamaños de las gotas generalmente requiere líquidos de perfluorocarbono estables con altos umbrales de activación que no son prácticos in vivo. Producir tamaños de gotas uniformes utilizando gases de bajo punto de ebullición sería beneficioso para los experimentos de imagen y terapia in vivo. Este artículo describe un método simple y económico para la formación de nanogotas de cambio de fase estabilizadas por lípidos filtradas por tamaño con decafluorobutano (DFB) de bajo punto de ebullición. Se describe un método común para generar microburbujas lipídicas, además de un nuevo método para condensarlas con extrusión a alta presión en un solo paso. Este método está diseñado para ahorrar tiempo, maximizar la eficiencia y generar mayores volúmenes de soluciones de microburbujas y nanogotas para una amplia variedad de aplicaciones utilizando equipos de laboratorio comunes que se encuentran en muchos laboratorios biológicos.

Introduction

Los agentes de contraste por ultrasonido (UCA) están creciendo rápidamente en popularidad para aplicaciones de imágenes y terapia. Las microburbujas, los UCA originales, son actualmente los agentes principales utilizados en aplicaciones de diagnóstico clínico. Las microburbujas son esferas llenas de gas, típicamente de 1-10 μm de diámetro, rodeadas de capas de lípidos, proteínas o polímeros1. Sin embargo, su tamaño y estabilidad in vivo pueden limitar su funcionalidad en muchas aplicaciones. Las nanogotas de cambio de fase, que contienen un núcleo líquido sobrecalentado, pueden superar algunas de estas limitaciones debido a su tamaño más pequeño y a la mejora de la vida útil ^{de la circulación2}. Cuando se expone al calor o a la energía acústica, el núcleo líquido sobrecalentado se vaporiza para formar una microburbuja de gas2,3,4,5. Dado que el umbral de vaporización está directamente relacionado con el tamaño de las ^gotas5,6, la formulación de suspensiones de gotas con un tamaño uniforme sería muy deseable para lograr umbrales de activación consistentes. Los métodos de formulación que producen tamaños de gotas uniformes son a menudo complejos y costosos, mientras que los enfoques más rentables dan como resultado soluciones de polidisperso7. Otra limitación es la capacidad de generar gotas estables de cambio de fase con gases perfluorocarbonos (PFC) de bajo punto de ebullición, lo cual es crítico para una activación eficiente in ^vivo8. En este manuscrito, se describe un protocolo para generar gotas de desplazamiento de fase vaporizables filtradas estables de bajo punto de ebullición para aplicaciones de imágenes y terapia in vivo.

Existen muchos métodos para producir gotas monodispersadas submicrónicas de desplazamiento de ^fase7. Uno de los métodos más robustos para controlar el tamaño es el uso de dispositivos microfluídicos. Estos dispositivos pueden ser costosos, tener tasas lentas de producción de gotas (~ 104-106 gotas / s)⁷ y requieren una capacitación extensa. Los dispositivos microfluídicos también requieren generalmente gases de alto punto de ebullición para evitar la vaporización espontánea y la obstrucción del ^sistema7. Sin embargo, un estudio reciente de gracia Lux et ^al.9 demuestra cómo el enfriamiento de un microfluidizador puede ser utilizado para generar altas concentraciones de cambio de fase submicrométrico (^1010-1012/mL) utilizando decafluorobutano de bajo punto de ebullición (DFB) u octafluoropropano (OFP).

En general, los gases de bajo punto de ebullición como DFB u OFP son más fáciles de manejar utilizando burbujas de gas preformadas. Las gotas vaporizables se pueden producir a partir de burbujas precursoras estabilizadas con lípidos condensando el gas utilizando bajas temperaturas y presión ^elevada5,10. La concentración de gotas producidas utilizando este método depende de la concentración de microburbujas precursoras y la eficiencia de la conversión de burbujas en gotas. Se han reportado microburbujas concentradas a partir de sonicación de puntas que se acercan a > ¹⁰¹⁰ MB/^mL11, mientras que un estudio separado ha reportado concentraciones de gotas que van desde ~1-3 ^x1011 gotas/ml de burbujas condensadas de OFP y ^DFP12. Cuando las gotas monodispersadas no son una preocupación, los métodos de condensación son los métodos más sencillos y de menor costo para generar gotas de cambio de fase estabilizadas con lípidos utilizando PFC de bajo punto de ebullición. Los métodos para generar burbujas de tamaño uniforme antes de la condensación pueden ayudar a crear poblaciones de gotas más monodispersas. Sin embargo, la generación de burbujas precursoras monodispersas también es difícil, ya que requiere enfoques más costosos como la microfluídica o las técnicas de centrifugación diferencial ^repetida11. Recientemente se ha publicado un enfoque alternativo para la producción de nanogotas DFB y OFB utilizando la nucleación espontánea de gotitas en ^liposomas13. Este método, que utiliza un efecto “Ouzo”, es una forma sencilla de generar gotas de PFC de bajo punto de ebullición sin necesidad de condensar burbujas. La distribución del tamaño de las gotas de PFC se puede controlar mediante la delicada titulación y mezcla de componentes de PFC, lípidos y etanol utilizados para iniciar la nucleación de las gotas. También vale la pena señalar que la mezcla de perfluorocarbonos se puede utilizar para controlar los umbrales de estabilidad y activación de las ^{nanogotas14,15}. Un trabajo más reciente de Shakya et al. demuestra cómo la activación de nanogotas se puede ajustar emulsionando PFC de alto punto de ebullición dentro de un endoesqueleto de hidrocarburos para facilitar la nucleación heterogénea dentro del núcleo de ^gotas16, que es un enfoque que se puede considerar junto con otras formas de filtración de tamaño de gotas.

Una vez formadas, las gotas de cambio de fase se pueden extruir después de la formación para crear poblaciones más monodispersas. De hecho, un protocolo similar al método aquí descrito ha sido publicado previamente por Kopechek et ^al.17 utilizando dodecofluorpentano de alto punto de ebullición (DDFP) como núcleo de gotas. Los lectores que buscan usar gotas de cambio de fase con perfluorocarbonos de alto punto de ebullición (estables a temperatura ambiente) deben consultar el artículo anterior en su lugar. Generar y extruir gotas con gases de bajo punto de ebullición, como DFB y OFP, es más complicado y se aborda mejor condensando burbujas de gas preformadas.

En este protocolo, se describe un método común para generar microburbujas lipídicas preformadas con un núcleo de gas DFB utilizando la sonicación de la punta de la sonda. A continuación, se utiliza una extrusora comercial para condensar microburbujas preformadas en nanogotas de desplazamiento de fase submicrónicas (Figura 1). Las gotas resultantes son activables por calor y ultrasonido. Este método puede producir mayores volúmenes de solución de nanogotas que los métodos de condensación convencionales con distribuciones de tamaño más estrechas sin la necesidad de costosos dispositivos microfluídicos. La producción de soluciones de nanogotas con distribuciones de tamaño estrechas probablemente puede generar umbrales de vaporización más uniformes. Esto maximizará su potencial para numerosas aplicaciones, como imágenes, ablación, administración de fármacos y embolización1,3,4,6.

Figura 1: Esquema de configuración de extrusión de alta presión para condensar microburbujas preformadas en nanogotas de cambio de fase. La solución de microburbuja se agrega y está contenida en la cámara extrusora, y se aplican 250 psi, del tanque de nitrógeno, a través de la válvula de entrada de la cámara. El gas nitrógeno empujará la solución de microburbuja a través del filtro en la base de la cámara, condensando la muestra en nanogotas. La solución finalmente se empuja fuera del extrusor a través del tubo de salida de la muestra y se recoge. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Hacer películas lipídicas Prepare películas lipídicas para la generación de microburbujas utilizando 90% DSPC y 10% DSPE-PEG2K mezclando los lípidos en la proporción correcta utilizando las siguientes instrucciones: Hacer lípidos de stock de DSPC y DSPE-PEG2K en cloroformo. Pesar 50 mg de cada polvo lipídico en viales separados. Añadir 1 ml de cloroformo a cada vial con una jeringa de vidrio de 1 ml. Añadir 287 μL de material DSPC y 113 μL de DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/ml) en un …

Representative Results

Los resultados representativos de la distribución de tamaño se incluyen mediante el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) y detección de pulso resistivo sintonizable (TRSP). La Figura 5 muestra la distribución de tamaño de las soluciones de burbujas condensadas con y sin extrusión. Sin extrusión, el protocolo termina en el paso 5.3. Las burbujas refrigeradas se condensan ventilando la muestra a presión atmosférica mientras está fría. La única muestra condensada tiene un…

Discussion

Hay disponible un cuerpo completo de literatura que analiza la formulación, la física y las aplicaciones potenciales de las microburbujas y las gotas de cambio de fase para imágenes y terapia in vivo. Esta discusión se refiere explícitamente a la generación de microburbujas lipídicas y su conversión en gotas de cambio de fase submicrométricas utilizando un gas DFB de bajo punto de ebullición y extrusión a alta presión. El método descrito aquí está destinado a proporcionar un método relativamente simple de…

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets