التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة من نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض
Summary
هنا ، يصف البروتوكول كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي تربى في نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. أيضا ، يمكن أن تشمل الجسم المضاد الثالث من مضيف مختلف في هذا البروتوكول. يمكن إجراء هذا النهج في أي نوع من الخلايا ومسببات الأمراض.
Abstract
في الوقت الحاضر ، من الممكن العثور على مجموعة واسعة من الأدوات الجزيئية المتاحة لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة الطفيلية. ومع ذلك ، توجد بعض القيود للحصول على أجسام مضادة تجارية وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة تتعرف على هياكل وبروتينات خلايا محددة في الطفيليات. إلى جانب ذلك ، هناك عدد قليل من الأجسام المضادة التجارية المتاحة لتسمية المثقبيات. عادة ، يتم تحضير الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد الطفيليات في المنزل ويمكن أن يكون من الصعب استخدامها مع الأجسام المضادة الأخرى المنتجة في نفس النوع. هنا ، يوضح البروتوكول كيفية استخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة وأحادية النسيلة التي تربى في نفس النوع لإجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض. لتحقيق التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات ، من الأهمية بمكان احتضان الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر أولا ثم اتباع الحضانة مع الجسم المضاد للفأر الثانوي IgG المقترن بأي فلوروكروم. بعد ذلك ، من الضروري اتخاذ خطوة حظر إضافية لمنع أي أثر للجسم المضاد الأساسي من التعرف عليه بواسطة الجسم المضاد الثانوي التالي. بعد ذلك ، تتم إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر وجسمه المضاد الثانوي من الفئة الفرعية IgG المقترن بفلوروكروم مختلف إلى العينة في الأوقات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن إجراء التألق المناعي الثلاثي لوضع العلامات باستخدام جسم مضاد ثالث يثار في نوع مختلف. أيضا ، يمكن تلطيخ هياكل مثل النوى والأكتين لاحقا بمركباتها أو ملصقاتها المحددة. وبالتالي ، يمكن تعديل هذه الأساليب المعروضة هنا لأي خلية تكون مصادرها من الأجسام المضادة الأولية محدودة.
Introduction
لدراسة تفاعل العامل الممرض مع الخلية المضيفة على المستوى الخلوي يوفر معلومات أساسية عن الأسباب الكامنة وراء المرض لأن مجموعات مختلفة ، مثل الفيروسات والبكتيريا والبروتوزوا ، يمكن أن تصيب معظم أنواع الخلايا المضيفة 1،2،3،4. يمكن أن يساعد أيضا في تطوير وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة التي يمكن أن تبطئ أو تمنع نمو العامل الممرض. في الظروف الحية، تكون الأجسام المضادة المنتجة مسؤولة عن التعرف على المكونات الذاتية، والمستضدات من الفيروسات، والمكونات أو المنتجات البكتيرية، والفطريات، والطفيليات، وغيرها5.
لهذا الغرض ، تستخدم الأجسام المضادة على نطاق واسع ، وذلك أساسا لفهم موقع ووظيفة الهياكل الخلوية والبروتينات. تظهر العديد من الدراسات التي تستخدم علامات متعددة للأجسام المضادة أن خطوات الحجب الإضافية تساهم في خصوصية تحديد الموقع المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الموصوفة أجساما مضادة تجارية وحيدة النسيلة محددة ، بما في ذلك الأجسام المضادة من نفس النوع المضيف6،7،8،9،10،11،12،13،14.
عادة ، يستخدم التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات جسمين مضادين تم تربيتهما في أنواع مختلفة لتلطيخ هياكل الخلايا ذات الأهمية أو مسببات الأمراض والخلايا المضيفة لرؤية التفاعل بينهما. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا مشكلة عندما لا تتوفر أجسام مضادة تجارية أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة ببعض مسببات الأمراض لإجراء وضع العلامات المزدوجة. أيضا ، هناك مجموعات اقتران الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ، ومن الممكن إقران الأجسام المضادة الأولية مباشرة بالفلوروفور عن طريق تفاعل إستر سكسينيميديل15. المشكلة هي أن هذه المجموعات غالبا ما تكون باهظة الثمن ، ومن الضروري أن يكون لديك ما يكفي من الأجسام المضادة لتصنيفها. مع العلم بذلك ، نجحنا في تطوير طريقة التألق المناعي المزدوج باستخدام جسمين مضادين مختلفين تم تربيتهما في نفس النوع لدراسة توطين البروتين في Trypanosoma brucei16. ومع ذلك ، بالنسبة للطفيليات داخل الخلايا ، بما في ذلك Trypanosoma cruzi ، لم يتم إثبات هذا النهج. هنا ، نوضح كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة طفيليات T. cruzi داخل الخلايا والخلية المضيفة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في نفس النوع دون تفاعلات متقاطعة. إلى جانب هذه الطريقة ، تم إنشاء علامة التألق المناعي الثلاثي مع إضافة الجسم المضاد الثالث من نوع مختلف. تساعد هذه الأساليب عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا ويمكن استخدامه في أي نوع من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء وضع العلامات المناعية المزدوجة في الخلايا المصابة بالمجربة الكروزية باستخدام جسمين مضادين مختلفين من نفس النوع المضيف. لدراسة ، بمزيد من التفصيل ، الآثار المترتبة على العدوى ، يمكن تسمية الهياكل في الخلية المضيفة مثل النواة أو العضيات الخلوية باستخدام ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة أمبارو في ولاية ساو باولو (FAPESP 2010/19547-1؛ 2018/03677-5) إلى MMAB، ومن مؤسسة Apoio ao Ensino، ومن Pesquisa e Assistência- FAEPA إلى MMAB، ومن قبل منسقة العلاقات العامة في نيفيل سوبيريور – البرازيل (CAPES) – الرمز المالي 001. حصلت CG-C على زمالة الماجستير والدكتوراه من CAPES وحصلت LAMT-S على زمالة الدكتوراه من CNPq. نشكر إليزابيتي ر. ميلاني على المساعدة في الفحص المجهري البؤري والدكتور داريو زامبوني على توفير خلايا LLC-MK2 (كلية ريبيراو بريتو الطبية ، USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
