Immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi della stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno
Summary
Qui, il protocollo descrive come eseguire l’immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno. Inoltre, può includere il terzo anticorpo di un ospite diverso in questo protocollo. Questo approccio può essere fatto in qualsiasi tipo di cellula e agenti patogeni.
Abstract
Al giorno d’oggi, è possibile trovare una vasta gamma di strumenti molecolari disponibili per studiare le interazioni parassita-cellula ospite. Tuttavia, esistono alcune limitazioni per ottenere anticorpi commerciali monoclonali o policlonali che riconoscono specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti. Inoltre, ci sono pochi anticorpi commerciali disponibili per etichettare i tripanosomatidi. Di solito, gli anticorpi policlonali contro i parassiti sono preparati internamente e potrebbero essere più difficili da usare in combinazione con altri anticorpi prodotti nella stessa specie. Qui, il protocollo dimostra come utilizzare anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie per eseguire l’immunofluorescenza a doppia etichettatura per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Per ottenere la doppia marcatura immunofluorescenza, è fondamentale incubare prima l’anticorpo policlonale di topo e poi seguire l’incubazione con l’anticorpo secondario IgG di topo coniugato a qualsiasi fluorocromo. Successivamente, è necessaria un’ulteriore fase di blocco per evitare che qualsiasi traccia dell’anticorpo primario venga riconosciuta dall’anticorpo secondario successivo. Quindi, un anticorpo monoclonale di topo e il suo specifico anticorpo secondario della sottoclasse IgG coniugato a un fluorocromo diverso vengono aggiunti al campione nei momenti appropriati. Inoltre, è possibile eseguire l’immunofluorescenza a tripla marcatura utilizzando un terzo anticorpo allevato in una specie diversa. Inoltre, strutture come nuclei e actina possono essere colorate successivamente con i loro composti o etichette specifici. Pertanto, questi approcci qui presentati possono essere regolati per qualsiasi cellula le cui fonti di anticorpi primari sono limitate.
Introduction
Studiare l’interazione del patogeno con la cellula ospite a livello cellulare fornisce informazioni essenziali sulle cause alla base della malattia poiché diversi gruppi, come virus, batteri e protozoi, possono infettare la maggior parte dei tipi di cellule ospiti1,2,3,4. Può anche aiutare a sviluppare e identificare potenziali bersagli terapeutici che possono rallentare o inibire la crescita del patogeno. In condizioni vive, gli anticorpi prodotti sono responsabili del riconoscimento di autocomponenti, antigeni da virus, componenti o prodotti batterici, funghi, parassiti e altri5.
A tale scopo, gli anticorpi sono strumenti ampiamente utilizzati, principalmente per comprendere la posizione e la funzione delle strutture cellulari e delle proteine. Diversi studi che utilizzano l’etichettatura multipla degli anticorpi dimostrano che ulteriori fasi di blocco contribuiscono alla specificità dell’immunolocalizzazione. Inoltre, la maggior parte dei protocolli descritti utilizza anticorpi monoclonali commerciali specifici, inclusi anticorpi della stessa specie ospite6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Di solito, l’immunofluorescenza a doppia etichettatura utilizza due anticorpi allevati in specie diverse per macchiare le strutture cellulari di interesse o i patogeni e le cellule ospiti per vedere l’interazione tra di loro. Tuttavia, questo può essere un problema quando non sono disponibili anticorpi commerciali monoclonali o policlonali specifici per alcuni agenti patogeni per eseguire la doppia etichettatura. Inoltre, esistono kit di coniugazione anticorpale disponibili in commercio ed è possibile coniugare gli anticorpi primari direttamente al fluoroforo mediante una reazione di estere succinimidile15. Il problema è che questi kit sono spesso costosi ed è necessario avere abbastanza anticorpi per etichettarli. Sapendo questo, abbiamo sviluppato con successo un metodo di doppia immunofluorescenza utilizzando due diversi anticorpi allevati nella stessa specie per studiare la localizzazione delle proteine nel Trypanosoma brucei16. Tuttavia, per i parassiti intracellulari, tra cui Trypanosoma cruzi, questo approccio non è stato dimostrato. Qui, mostriamo come eseguire l’immunofluorescenza a doppia marcatura per studiare i parassiti intracellulari di T. cruzi e la cellula ospite utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie senza reazioni crociate. Oltre a questo metodo, è stata stabilita una tripla etichettatura di immunofluorescenza con l’aggiunta del terzo anticorpo di una specie diversa. Questi approcci aiutano quando la fonte di anticorpi è limitata e può essere utilizzata in qualsiasi tipo di cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire la doppia immunolabeling nelle cellule infette da Trypanosoma cruzi utilizzando due diversi anticorpi della stessa specie ospite. Per studiare, con maggiori dettagli, le implicazioni dell’infezione, le strutture nella cellula ospite come il nucleo o gli organelli citosolici possono essere etichettate utilizzando questo protocollo. Inoltre, può essere utilizzato nel metodo di etichettatura immunogold a sezione sottile post-incorporamento. Questo approccio aiuta a super…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) alla MMAB, dalla Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA alla MMAB e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – codice finanziario 001. CG-C ha ricevuto un master e una borsa di dottorato da CAPES e LAMT-S ha ricevuto una borsa di dottorato da CNPq. Ringraziamo Elizabete R. Milani per l’assistenza alla microscopia confocale e il Dr. Dario Zamboni per aver fornito cellule LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
