Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans
Summary
Burada protokol, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. Ayrıca, bu protokole farklı bir konaktan gelen üçüncü antikorları da içerebilir. Bu yaklaşım herhangi bir hücre tipinde ve patojende yapılabilir.
Abstract
Günümüzde, parazit konak hücre etkileşimlerini incelemek için çok çeşitli moleküler araçlar bulmak mümkündür. Bununla birlikte, parazitlerdeki belirli hücre yapılarını ve proteinleri tanıyan ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar elde etmek için bazı sınırlamalar vardır. Ayrıca, tripozosatomatidleri etiketlemek için çok az ticari antikor vardır. Genellikle, parazitlere karşı poliklonal antikorlar şirket içinde hazırlanır ve aynı türde üretilen diğer antikorlarla birlikte kullanılması daha zor olabilir. Burada protokol, konak hücre ve patojen etkileşimlerini incelemek için çift etiketleme immünofluoresansı gerçekleştirmek için aynı türde yetiştirilen poliklonal ve monoklonal antikorların nasıl kullanılacağını göstermektedir. Çift etiketleme immünoflorooresansı elde etmek için, önce fare poliklonal antikorunu kuluçkaya yatırmak ve daha sonra herhangi bir florroma konjuge edilen ikincil fare IgG antikoru ile inkübasyonu takip etmek çok önemlidir. Bundan sonra, birincil antikorun herhangi bir izinin bir sonraki ikincil antikor tarafından tanınmasını önlemek için ek bir engelleme adımı gereklidir. Daha sonra, bir fare monoklonal antikoru ve farklı bir florokroma konjuge edilen spesifik IgG alt sınıfı ikincil antikor uygun zamanlarda numuneye eklenir. Ek olarak, farklı bir türde yetiştirilen üçüncü bir antikor kullanarak üçlü etiketleme immünofluoresans yapmak mümkündür. Ayrıca, çekirdek ve aksin gibi yapılar daha sonra özel bileşikleri veya etiketleri ile lekelenebilir. Böylece, burada sunulan bu yaklaşımlar, birincil antikor kaynakları sınırlı olan herhangi bir hücre için ayarlanabilir.
Introduction
Patojenin hücresel düzeyde konak hücre ile etkileşimini incelemek için, virüsler, bakteriler ve protozoa gibi farklı gruplar çoğu konak hücre tipini enfekte edebileceğinden, hastalığın altında kalan nedenler hakkında temel bilgiler sağlar1,2,3,4. Ayrıca patojenin büyümesini yavaşlatabilecek veya inhibe edebilecek potansiyel terapötik hedeflerin geliştirilmesine ve tanımlanmasına yardımcı olabilir. Canlı koşullarda, üretilen antikorlar öz bileşenleri, virüslerden antijenleri, bakteriyel bileşenleri veya ürünleri, mantarları, parazitleri ve diğerlerini tanımaktan sorumludur5.
Bu amaçla, antikorlar, esas olarak hücresel yapıların ve proteinlerin yerini ve işlevini anlamak için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Çoklu antikor etiketlemesi kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalar, ek engelleme adımlarının immünolokalizasyonun özgüllüğüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, açıklanan protokollerin çoğu, aynı konak türlerinden antikorlar da dahil olmak üzere belirli ticari monoklonal antikorlar kullanır6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Genellikle, çift etiketleme immünofluoresans, ilgi çekici hücre yapılarını veya patojenleri ve konak hücreleri aralarındaki etkileşimi görmek için lekelamak için farklı türlerde yetiştirilen iki antikor kullanır. Bununla birlikte, bazı patojenler için özel ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar çift etiketleme yapmak için mevcut olmadığında bu bir sorun olabilir. Ayrıca, piyasada bulunan antikor konjugasyon kitleri vardır ve birincil antikorları doğrudan florimidil ester reaksiyonu ile florofora konjuge etmek mümkündür15. Sorun, bu kitlerin genellikle pahalı olması ve onları etiketlemek için yeterli antikora sahip olmak gerekir. Bunu bilerek, Trypanosoma brucei16’da protein lokalizasyonunu incelemek için aynı türde yetiştirilen iki farklı antikoru kullanarak çift immünofluoresans yöntemini başarıyla geliştirdik. Bununla birlikte, Trypanosoma cruzi de dahil olmak üzere hücre içi parazitler için bu yaklaşım gösterilmemiştir. Burada, hücre içi T. cruzi parazitlerini ve konak hücreyi çapraz reaksiyonlar olmadan aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak incelemek için çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemin yanı sıra, farklı bir türden üçüncü antikorun eklenmesiyle üçlü bir immünofluoresans etiketlemesi kurulmuştur. Bu yaklaşımlar antikor kaynağı sınırlı olduğunda ve herhangi bir hücre tipinde kullanılabildiğinde yardımcı olur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, aynı konak türlerinden iki farklı antikor kullanarak Trypanosoma cruzi enfekte hücrelerinde çift immünolabeling yapmak için bir protokol sunuyoruz. Daha ayrıntılı olarak, enfeksiyonun etkilerini incelemek için, çekirdek veya sitosoleik organeller gibi konak hücredeki yapılar bu protokol kullanılarak etiketlenebilir. Ayrıca, gömme sonrası ince kesit immüngold etiketleme yönteminde de kullanılabilir. Bu yaklaşım, tripozomatidleri ve diğer parazitleri incelemek için birkaç antikoru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) mmab için, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA MMAB ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – finans kodu 001. CG-C CAPES’ten yüksek lisans ve doktora bursu, LAMT-S ise CNPq’den doktora bursu aldı. Konfokal mikroskopi yardımı için Elizabete R. Milani’ye ve LLC-MK2 hücreleri sağladığı için Dr. Dario Zamboni’ye teşekkür ederiz (Ribeirao Preto Tıp Fakültesi, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
