إعداد واسع النطاق للسائل الزليلي الوسيط الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي 3D
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الإكسوسومات من الدرجة GMP من الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي باستخدام مفاعل حيوي 3D.
Abstract
تم اقتراح الإكسوسومات التي تفرزها الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمرشحين واعدين لإصابات الغضاريف وعلاج هشاشة العظام. تتطلب الإكسوسومات للتطبيق السريري إنتاجا واسع النطاق. وتحقيقا لهذا الهدف، نمت مركبات MSCs للسائل الزليلي البشري (hSF-MSCs) على حبات حاملة للصغر، ثم زرعت في نظام استزراع ديناميكي ثلاثي الأبعاد (3D). من خلال استخدام الثقافة الديناميكية 3D ، نجح هذا البروتوكول في الحصول على إكسوسومات واسعة النطاق من سوبرناتورز ثقافة SF-MSC. تم حصاد الإكسوسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق والتحقق منها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل ، وفحص انتقال الجسيمات النانوية ، والنشاف الغربي. أيضا ، تم الكشف عن السلامة الميكروبيولوجية للإكسوسومات. تشير نتائج الكشف عن الإكسوسومات إلى أن هذا النهج يمكن أن ينتج عددا كبيرا من الإكسوسومات الجيدة من فئة ممارسات التصنيع (GMP). يمكن استخدام هذه الإكسوسومات في أبحاث البيولوجيا الإكسوسومية وعلاج هشاشة العظام السريرية.
Introduction
لا يزال الفصال العظمي (OA) ، الناتج عن غضروف المفاصل وانهيار العظام الأساسي ، يمثل تحديا شديدا يؤدي إلى الإعاقة 1,2. بدون إمدادات الدم والأعصاب ، تكون قدرة الغضروف على الشفاء الذاتي ضئيلة بمجرد الإصابة 3,4. في العقود الماضية ، حققت العلاجات القائمة على زرع الخلايا الغضروفية الذاتية (ACI) بعض التقدم في علاج OA5. لعزل الخلايا الغضروفية وتوسيعها ، من الضروري حصاد غضروف صغير من المنطقة غير الحاملة للوزن في مفصل OA ، مما يسبب إصابات في الغضروف. أيضا ، سيتطلب الإجراء عملية ثانية لزرع الخلايا الغضروفية الموسعة6. وبالتالي ، فإن العلاجات المكونة من خطوة واحدة لعلاج OA دون إصابات الغضروف تخضع لاستكشاف مكثف.
تم اقتراح الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كبدائل واعدة لعلاج OA 7,8. تنشأ MSCs من أنسجة متعددة ، ويمكن أن تتمايز إلى خلايا غضروفية مع تحفيز محدد. الأهم من ذلك ، يمكن ل MSCs تعديل الاستجابات المناعية عبر مضاد للالتهابات9. لذلك ، فإن MSCs لها مزايا كبيرة في علاج OA عن طريق إصلاح عيوب الغضروف وتعديل الاستجابة المناعية ، خاصة في بيئة الالتهاب. بالنسبة لعلاج OA ، جذبت MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) مؤخرا الكثير من الاهتمام بسبب قدرتها على تمايز الخلايا الغضروفية الأقوى من مصادر MSC الأخرى10,11. والجدير بالذكر أنه في عيادة العظام ، يعد استخراج SF الالتهابي من تجويف المفصل علاجا روتينيا لتخفيف أعراض الألم لدى مرضى OA. عادة ما يتم التخلص من SF الالتهابي المستخرج كنفايات طبية. كل من المرضى والأطباء على استعداد للنظر في MSCs الذاتية المعزولة عن SF الالتهابية كعلاج OA مع عدد قليل جدا من الصراعات الأخلاقية. ومع ذلك ، فإن علاج SF-MSC معرض للخطر بسبب المخاطر السرطانية ، والتخزين طويل الأمد ، وحواجز الشحن البعيدة.
تحمل الإكسوسومات ، التي تفرزها العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك MSCs ، معظم المعلومات الحيوية للخلية الأم. وقد تم التحقيق فيه بشكل متعمق كعلاج خال من الخلايا12,13. وفقا للموارد المحدثة المتاحة على موقع حكومة التجارب السريرية (ClinicalTrials.gov) ، يتم بدء دراسات سريرية أكثر شمولا وإجراؤها في مجالات أبحاث السرطان وارتفاع ضغط الدم والأمراض العصبية التنكسية. يمكن أن يكون علاج الإكسوسوم SF-MSC تجربة مثيرة وصعبة للتعامل مع OA. يعد إنتاج الإكسوسومات من فئة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) والإنتاج الخارجي على نطاق واسع أمرا ضروريا للترجمة السريرية. تم إجراء عزل الإكسوسوم على نطاق صغير على نطاق واسع على أساس زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، تحتاج استراتيجيات إنتاج exosome واسعة النطاق إلى التحسين. تم تطوير طريقة تصنيع إكسوسوم واسعة النطاق في هذه الدراسة ، استنادا إلى ثقافة SF-MSC الضخمة في ظروف خالية من الأجانب. بعد الطرد المركزي الفائق من المواد الفائقة لزراعة الخلايا ، تم التحقق من سلامة ووظيفة الإكسوزوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة على نطاق واسع في الطب التجديدي بسبب تجديدها الذاتي ، وتمييزها إلى خلايا الأنسجة ذات الوظائف المتخصصة ، وتأثيرات paracrine16,17. ومن الجدير بالذكر أن تأثيرات الباراكرين التي تمارسها الإكسوسومات قد جذبت الكثير من الاهتمام<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81972116، رقم 81972085، رقم 81772394)؛ البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (No.2018B0303110003) ؛ مشروع قوانغدونغ للتعاون الدولي (No.2021A0505030011)؛ مشاريع شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (No.2020M682907) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية الأساسية (رقم 2021A1515010985) ؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201612079) ؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات رفيعة المستوى في مقاطعة قوانغدونغ.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -. J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
