Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.
Abstract
Gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati suggeriti come candidati promettenti per le lesioni della cartilagine e il trattamento dell’osteoartrite. Gli esosomi per applicazioni cliniche richiedono una produzione su larga scala. A tal fine, le MSC del liquido sinoviale umano (hSF-MSCs) sono state coltivate su perle di microcarrier e quindi coltivate in un sistema di coltura dinamico tridimensionale (3D). Attraverso l’utilizzo di colture dinamiche 3D, questo protocollo ha ottenuto con successo esosomi su larga scala da supernatanti di coltura SF-MSC. Gli esosomi sono stati raccolti mediante ultracentrifugazione e verificati da un microscopio elettronico a trasmissione, saggio di trasmissione di nanoparticelle e western blotting. Inoltre, è stata rilevata la sicurezza microbiologica degli esosomi. I risultati del rilevamento degli esosomi suggeriscono che questo approccio può produrre un gran numero di esosomi di grado GMP (Good Manufacturing Practices). Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell’osteoartrite.
Introduction
L’osteoartrite (OA), derivante dalla cartilagine articolare e dalla rottura ossea sottostante, rimane una grave sfida che porta alla disabilità 1,2. Senza l’apporto di sangue e nervi, la capacità di auto-guarigione della cartilagine è minima una volta feriti 3,4. Negli ultimi decenni, le terapie basate sull’impianto autologo di condrociti (ACI) hanno fatto alcuni progressi nel trattamento dell’OA5. Per l’isolamento e l’espansione dei condrociti, è necessario raccogliere una piccola cartilagine dall’area non portante dell’articolazione OA, causando lesioni alla cartilagine. Inoltre, la procedura richiederà una seconda operazione per impiantare i condrociti espansi6. Pertanto, le terapie in un’unica fase per il trattamento dell’OA senza lesioni della cartilagine sono in fase di ampia esplorazione.
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state suggerite come alternative promettenti per il trattamento dell’OA 7,8. Originate da più tessuti, le MSC possono differenziarsi in condrociti con una stimolazione specifica. È importante sottolineare che le MSC possono modulare le risposte immunitarie tramite l’anti-infiammazione9. Pertanto, le MSC hanno vantaggi significativi nel trattamento dell’OA riparando i difetti della cartilagine e modulando la risposta immunitaria, specialmente nell’ambiente infiammatorio. Per il trattamento dell’OA, le MSC da liquido sinoviale (SF-MSCs) hanno recentemente attirato molta attenzione a causa della loro più forte capacità di differenziazione dei condrociti rispetto ad altre fonti di MSC10,11. In particolare, presso la clinica ortopedica, l’estrazione di SF infiammatoria dalla cavità articolare è una terapia di routine per alleviare il sintomo del dolore dei pazienti con OA. La SF infiammatoria estratta di solito viene smaltita come rifiuto medico. Sia i pazienti che i medici sono pronti a considerare le MSC autologhe isolate dalla SF infiammatoria come trattamento OA con pochissimi conflitti etici. Tuttavia, la terapia con SF-MSC è compromessa a causa dei rischi tumorigenici, della conservazione a lungo termine e delle barriere di spedizione distanti.
Gli esosomi, secreti da molti tipi di cellule, comprese le MSC, trasportano la maggior parte delle bio-informazioni della cellula madre. È stato studiato in modo approfondito come terapia cell-free12,13. Secondo le risorse aggiornate disponibili sul sito web del governo della sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov), vengono avviati e intrapresi studi clinici sugli esosomi più ampi nei campi di ricerca del cancro, dell’ipertensione e delle malattie neurodegenerative. Il trattamento degli esosomi SF-MSC potrebbe essere uno studio entusiasmante e impegnativo per far fronte all’OA. La produzione di esosomi di grado GMP e su larga scala è essenziale per la traduzione clinica. L’isolamento degli esosomi su piccola scala è stato ampiamente eseguito sulla base di colture cellulari bidimensionali (2D). Tuttavia, le strategie di produzione di esosomi su larga scala devono essere ottimizzate. In questo studio è stato sviluppato un metodo di produzione di esosomi su larga scala, basato su una massiccia coltura SF-MSC in condizioni prive di xeno. Dopo l’ultracentrifugazione da supernatanti di coltura cellulare, sono state convalidate la sicurezza e la funzione degli esosomi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule staminali mesenchimali sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa grazie al loro auto-rinnovamento, differenziate in cellule tissutali con funzioni specializzate ed effetti paracrini16,17. In particolare, gli effetti paracrini esercitati dagli esosomi hanno attirato molta attenzione18. Gli esosomi trasportano le bioinformazioni delle MSC e svolgono la loro funzione biologica e superano le carenze delle MSC, com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Natural Science Foundation of China (n. 81972116, n. 81972085, n. 81772394); Programma chiave della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong (No.2018B0303110003); Progetto di cooperazione internazionale del Guangdong (n. 2021A0505030011); Progetti scientifici e tecnologici di Shenzhen (n. GJHZ20200731095606019, n. JCYJ20170817172023838, n. JCYJ20170306092215436, n. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Progetto Sanming di Medicina a Shenzhen (SZSM201612079); Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
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