Здесь мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием 3D-биореактора.
Экзосомы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), были предложены в качестве перспективных кандидатов для травм хряща и лечения остеоартрита. Экзосомы для клинического применения требуют крупномасштабного производства. С этой целью МСК синовиальной жидкости человека (hSF-МСК) выращивали на бусинах микроносителей, а затем культивировали в динамической трехмерной (3D) системе культивирования. Используя 3D-динамическую культуру, этот протокол успешно получил крупномасштабные экзосомы из супернатантов культуры SF-MSC. Экзосомы были собраны методом ультрацентрифугирования и проверены просвечивающим электронным микроскопом, анализом передачи наночастиц и западным блоттингом. Также выявлена микробиологическая безопасность экзосом. Результаты обнаружения экзосом свидетельствуют о том, что этот подход может привести к образованию большого количества экзосом надлежащей производственной практики (GMP). Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения остеоартрита.
Остеоартрит (ОА), возникающий в результате разрушения суставного хряща и лежащей в его основе кости, остается серьезной проблемой, приводящей к инвалидности 1,2. Без крово- и нервного снабжения способность хряща к самовосстановлению минимальна после травмирования 3,4. В последние десятилетия методы лечения, основанные на аутологичной имплантации хондроцитов (ACI), достигли некоторого прогресса в лечении ОА5. Для выделения и расширения хондроцитов необходим сбор небольшого хряща из ненесущей области сустава ОА, что приводит к травмам хряща. Также процедура потребует повторной операции по имплантации расширенных хондроцитов6. Таким образом, одноэтапная терапия для лечения ОА без повреждений хряща находится в стадии обширного изучения.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были предложены в качестве перспективных альтернатив для лечения ОА 7,8. Происходящие из нескольких тканей, МСК могут дифференцироваться в хондроциты со специфической стимуляцией. Важно отметить, что МСК могут модулировать иммунные реакции с помощью противовоспалительногосредства 9. Таким образом, МСК обладают значительными преимуществами в лечении ОА, восстанавливая дефекты хряща и модулируя иммунный ответ, особенно в среде воспаления. Для лечения ОА МСК из синовиальной жидкости (SF-МСК) в последнее время привлекли большое внимание из-за их более сильной способности дифференцировки хондроцитов, чем другие источники МСК10,11. Примечательно, что в ортопедической клинике удаление воспалительной СФ из полости сустава является рутинной терапией для облегчения болевого симптома пациентов с ОА. Экстрагированная воспалительная НФ обычно утилизируется как медицинские отходы. Как пациенты, так и врачи готовы рассматривать аутологичные МСК, выделенные из воспалительной СФ, как лечение ОА с очень небольшим количеством этических конфликтов. Тем не менее, терапия SF-MSC скомпрометирована из-за опухолевых рисков, длительного хранения и отдаленных барьеров транспортировки.
Экзосомы, секретируемые многими типами клеток, включая МСК, несут большую часть биоинформации родительских клеток. Он был подробно исследован как бесклеточная терапия12,13. Согласно обновленным ресурсам, доступным на веб-сайте правительства по клиническим испытаниям (ClinicalTrials.gov), начинаются и проводятся более обширные клинические исследования экзосом в областях исследований рака, гипертонии и нейродегенеративных заболеваний. Лечение экзосом SF-MSC может быть захватывающим и сложным испытанием, чтобы справиться с ОА. Надлежащая производственная практика (GMP) и крупномасштабное производство экзосом имеют важное значение для клинического перевода. Мелкомасштабная изоляция экзосом была широко выполнена на основе двумерной (2D) клеточной культуры. Однако крупномасштабные стратегии производства экзосом нуждаются в оптимизации. В этом исследовании был разработан крупномасштабный метод производства экзосом, основанный на массивной культуре SF-MSC в условиях, свободных от ксено. После ультрацентрифугирования из супернатантов клеточной культуры была подтверждена безопасность и функция экзосом.
Мезенхимальные стволовые клетки широко используются в регенеративной медицине благодаря их самообновлению, дифференцированному в тканевые клетки со специализированными функциями и паракринным эффектам16,17. Примечательно, что паракринные эффекты, ока?…
The authors have nothing to disclose.
Национальный фонд естественных наук Китая (No 81972116, No 81972085, No 81772394); Ключевая программа Фонда естественных наук провинции Гуандун (No2018B0303110003); Гуандунский проект международного сотрудничества (No 2021A0505030011); Шэньчжэньские научно-технические проекты (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Китайский постдокторский научный фонд (No 2020M682907); Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (No 2021A1515010985); Санминский медицинский проект в Шэньчжэне (SZSM201612079); Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун.
BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
TEM | JEM-1200EX | ||
The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |