Крупномасштабное получение мезенхимальных экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости, с помощью 3D-культуры биореактора
Summary
Здесь мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием 3D-биореактора.
Abstract
Экзосомы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), были предложены в качестве перспективных кандидатов для травм хряща и лечения остеоартрита. Экзосомы для клинического применения требуют крупномасштабного производства. С этой целью МСК синовиальной жидкости человека (hSF-МСК) выращивали на бусинах микроносителей, а затем культивировали в динамической трехмерной (3D) системе культивирования. Используя 3D-динамическую культуру, этот протокол успешно получил крупномасштабные экзосомы из супернатантов культуры SF-MSC. Экзосомы были собраны методом ультрацентрифугирования и проверены просвечивающим электронным микроскопом, анализом передачи наночастиц и западным блоттингом. Также выявлена микробиологическая безопасность экзосом. Результаты обнаружения экзосом свидетельствуют о том, что этот подход может привести к образованию большого количества экзосом надлежащей производственной практики (GMP). Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения остеоартрита.
Introduction
Остеоартрит (ОА), возникающий в результате разрушения суставного хряща и лежащей в его основе кости, остается серьезной проблемой, приводящей к инвалидности 1,2. Без крово- и нервного снабжения способность хряща к самовосстановлению минимальна после травмирования 3,4. В последние десятилетия методы лечения, основанные на аутологичной имплантации хондроцитов (ACI), достигли некоторого прогресса в лечении ОА5. Для выделения и расширения хондроцитов необходим сбор небольшого хряща из ненесущей области сустава ОА, что приводит к травмам хряща. Также процедура потребует повторной операции по имплантации расширенных хондроцитов6. Таким образом, одноэтапная терапия для лечения ОА без повреждений хряща находится в стадии обширного изучения.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были предложены в качестве перспективных альтернатив для лечения ОА 7,8. Происходящие из нескольких тканей, МСК могут дифференцироваться в хондроциты со специфической стимуляцией. Важно отметить, что МСК могут модулировать иммунные реакции с помощью противовоспалительногосредства 9. Таким образом, МСК обладают значительными преимуществами в лечении ОА, восстанавливая дефекты хряща и модулируя иммунный ответ, особенно в среде воспаления. Для лечения ОА МСК из синовиальной жидкости (SF-МСК) в последнее время привлекли большое внимание из-за их более сильной способности дифференцировки хондроцитов, чем другие источники МСК10,11. Примечательно, что в ортопедической клинике удаление воспалительной СФ из полости сустава является рутинной терапией для облегчения болевого симптома пациентов с ОА. Экстрагированная воспалительная НФ обычно утилизируется как медицинские отходы. Как пациенты, так и врачи готовы рассматривать аутологичные МСК, выделенные из воспалительной СФ, как лечение ОА с очень небольшим количеством этических конфликтов. Тем не менее, терапия SF-MSC скомпрометирована из-за опухолевых рисков, длительного хранения и отдаленных барьеров транспортировки.
Экзосомы, секретируемые многими типами клеток, включая МСК, несут большую часть биоинформации родительских клеток. Он был подробно исследован как бесклеточная терапия12,13. Согласно обновленным ресурсам, доступным на веб-сайте правительства по клиническим испытаниям (ClinicalTrials.gov), начинаются и проводятся более обширные клинические исследования экзосом в областях исследований рака, гипертонии и нейродегенеративных заболеваний. Лечение экзосом SF-MSC может быть захватывающим и сложным испытанием, чтобы справиться с ОА. Надлежащая производственная практика (GMP) и крупномасштабное производство экзосом имеют важное значение для клинического перевода. Мелкомасштабная изоляция экзосом была широко выполнена на основе двумерной (2D) клеточной культуры. Однако крупномасштабные стратегии производства экзосом нуждаются в оптимизации. В этом исследовании был разработан крупномасштабный метод производства экзосом, основанный на массивной культуре SF-MSC в условиях, свободных от ксено. После ультрацентрифугирования из супернатантов клеточной культуры была подтверждена безопасность и функция экзосом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мезенхимальные стволовые клетки широко используются в регенеративной медицине благодаря их самообновлению, дифференцированному в тканевые клетки со специализированными функциями и паракринным эффектам16,17. Примечательно, что паракринные эффекты, ока?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Национальный фонд естественных наук Китая (No 81972116, No 81972085, No 81772394); Ключевая программа Фонда естественных наук провинции Гуандун (No2018B0303110003); Гуандунский проект международного сотрудничества (No 2021A0505030011); Шэньчжэньские научно-технические проекты (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Китайский постдокторский научный фонд (No 2020M682907); Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (No 2021A1515010985); Санминский медицинский проект в Шэньчжэне (SZSM201612079); Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -. J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
