3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조
Summary
여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
중간엽 줄기세포(MSC)에서 분비되는 엑소좀은 연골 손상 및 골관절염 치료의 유망한 후보로 제안되었습니다. 임상 적용을 위한 엑소좀은 대규모 생산이 필요합니다. 이를 위해 인간 활액 MSC(hSF-MSC)를 마이크로캐리어 비드에서 성장시킨 다음 동적 3차원(3D) 배양 시스템에서 배양했습니다. 이 프로토콜은 3D 동적 배양을 활용하여 SF-MSC 배양 상청액에서 대규모 엑소좀을 성공적으로 획득했습니다. 엑소좀을 초원심분리로 수확하고 투과전자현미경, 나노입자 투과분석법 및 웨스턴 블로팅으로 검증하였다. 또한 엑소 좀의 미생물 학적 안전성이 검출되었습니다. 엑소좀 검출 결과는 이 접근법이 우수제조관리기준(GMP) 등급 엑소좀을 많이 생산할 수 있음을 시사합니다. 이러한 엑소좀은 엑소좀 생물학 연구 및 임상 골관절염 치료에 활용될 수 있습니다.
Introduction
관절 연골과 기저 뼈 파괴로 인한 골관절염(OA)은 장애 1,2로 이어지는 심각한 문제로 남아 있습니다. 혈액과 신경 공급이 없으면 연골자가 치유 능력은 일단 손상되면 최소화됩니다 3,4. 지난 수십 년 동안 자가 연골세포 이식(ACI)에 기초한 치료법은OA 치료에서 약간의 진전을 이루었습니다5. 연골 세포 분리 및 확장을 위해서는 OA 관절의 비 중량 부위에서 작은 연골을 채취하여 연골에 손상을 입힐 필요가 있습니다. 또한, 절차는 확장 된 연골 세포(6)를 이식하기위한 두 번째 수술을 요구할 것이다. 따라서 연골 손상없이 OA 치료를위한 1 단계 요법이 광범위하게 연구되고 있습니다.
중간엽 줄기세포(MSC)는 OA 치료 7,8을 위한 유망한 대안으로 제안되었습니다. 여러 조직에서 유래 한 MSC는 특정 자극으로 연골 세포로 분화 할 수 있습니다. 중요하게도, MSC는 항염증9을 통해 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서 MSC는 연골 결함을 복구하고 특히 염증 환경에서 면역 반응을 조절함으로써 OA 치료에서 상당한 이점을 가지고 있습니다. OA 치료의 경우, 활액(SF-MSC)의 MSC는 다른 MSC 공급원보다 더 강한 연골세포 분화 능력으로 인해 최근 많은 관심을 받고 있습니다10,11. 특히, 정형 외과 클리닉에서 관절강에서 염증성 SF를 추출하는 것은 OA 환자의 통증 증상을 완화하기위한 일상적인 치료법입니다. 추출 된 염증성 SF는 일반적으로 의료 폐기물로 처리됩니다. 환자와 의사 모두 염증성 SF에서 분리 된자가 MSC를 윤리적 갈등이 거의없는 OA 치료제로 고려할 준비가되어 있습니다. 그러나 SF-MSC 요법은 종양 발생 위험, 장기간 보관 및 먼 선적 장벽으로 인해 손상됩니다.
MSC를 포함한 많은 세포 유형에서 분비되는 엑소좀은 대부분의 모 세포 생체 정보를 전달합니다. 무세포 요법12,13으로 심층적으로 조사되었습니다. 임상 시험 정부 (ClinicalTrials.gov) 웹 사이트에서 제공되는 업데이트 된 리소스에 따르면 암, 고혈압 및 신경 퇴행성 질환의 연구 분야에서보다 광범위한 엑소 좀 임상 연구가 시작되고 수행됩니다. SF-MSC 엑소좀 치료는 OA에 대처하기 위한 흥미롭고 도전적인 시험이 될 수 있습니다. 우수제조관리기준(GMP) 등급 및 대규모 엑소좀 생산은 임상 번역에 필수적입니다. 소규모 엑소좀 분리는 2차원(2D) 세포 배양을 기반으로 널리 수행되었습니다. 그러나 대규모 엑소좀 생산 전략은 최적화가 필요합니다. 본 연구에서는 이물질이 없는 조건에서 대규모 SF-MSC 배양을 기반으로 대규모 엑소좀 제조 방법이 개발되었습니다. 세포 배양 상청액에서 초원심분리 후, 엑소좀의 안전성과 기능을 검증하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중간엽 줄기세포는 자가 재생, 특수 기능을 가진 조직세포로 분화, 파라크린 효과로 인해 재생 의학에서 널리 사용되고 있습니다16,17. 특히, 엑소좀이 발휘하는 파라크린 효과는 많은 관심을 끌었습니다18. 엑소좀은 MSC의 생체 정보를 전달하고 생물학적 기능을 수행하며 번거로운 보관 및 출하 등 MSC 단점을 극복합니다. 따라서 중간엽?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중국 국립 자연 과학 재단 (제 81972116 호, 제 81972085 호, 제 81772394 호); 광동성 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No.2018B0303110003); 광동 국제 협력 프로젝트 (No.2021A0505030011); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. GJHZ20200731095606019, 아니오. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); 중국 박사후 과학 재단 (No.2020M682907); 광동 기초 및 응용 기초 연구 재단 (No.2021A1515010985); 심천에서 의학의 Sanming 프로젝트 (SZSM201612079); 광동성의 고급 병원 건설을위한 특별 기금.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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