En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

Summary

Den gliom stamceller (GSCs) er en lille brøkdel af kræftceller, der spiller væsentlige roller i tumor indledning, angiogenese, og resistens i glioblastom (GBM), den mest udbredte og ødelæggende primære hjernesvulst. Tilstedeværelsen af GSCs gør GBM meget ildfast til de fleste af de enkelte målrettede agenter, så high-throughput screening metoder er nødvendige for at identificere potentielle effektive kombination therapeutics. Protokollen beskriver en simpel arbejdsgang for at muliggøre hurtig screening for potentiel kombinationsbehandling med synergistisk interaktion. De generelle trin i denne arbejdsgang består i at etablere luciferase-taggede GSC’er, forberede matrigelbelagte plader, kombinationslægemiddelscreening, analyse og validering af resultaterne.

Abstract

Den gliom stamceller (GSCs) er en lille brøkdel af kræftceller, der spiller væsentlige roller i tumor indledning, angiogenese, og resistens i glioblastom (GBM), den mest udbredte og ødelæggende primære hjernesvulst. Tilstedeværelsen af GSCs gør GBM meget ildfast til de fleste af de enkelte målrettede agenter, så high-throughput screening metoder er nødvendige for at identificere potentielle effektive kombination therapeutics. Protokollen beskriver en simpel arbejdsgang for at muliggøre hurtig screening for potentiel kombinationsbehandling med synergistisk interaktion. De generelle trin i denne arbejdsgang består i at etablere luciferase-taggede GSC’er, forberede matrigelbelagte plader, kombinationslægemiddelscreening, analyse og validering af resultaterne.

Introduction

Glioblastoma (GBM) er den mest almindelige og aggressive type primær hjernesvulst. I øjeblikket er den samlede overlevelse for GBM-patienter, der fik maksimal behandling (en kombination af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling) stadig kortere end 15 måneder; så nye og effektive behandlinger for GBM er presserende behov.

Tilstedeværelsen af glioom stamceller (GSC’ er) i GBM udgør en betydelig udfordring for den konventionelle behandling, da disse stamceller spiller afgørende roller i vedligeholdelsen af tumormikromiljø, lægemiddelresistens og tumorrecidiv¹. Derfor kan målretning af GSC’er være en lovende strategi for GBM-behandling². Ikke desto mindre, en stor ulempe for lægemidlets effektivitet i GBM er dens heterogenetiske karakter, herunder men ikke begrænset til forskellen i genetiske mutationer, blandede undertyper, epigenetisk regulering, og tumor mikromiljø, som gør dem meget ildfast til behandling. Efter mange mislykkede kliniske forsøg indså forskere og kliniske forskere, at målrettet behandling med et enkelt middel sandsynligvis ikke er i stand til fuldt ud at kontrollere udviklingen af meget heterogene kræftformer som GBM. Mens omhyggeligt udvalgte lægemiddelkombinationer er blevet godkendt for deres effektivitet ved synergistisk at øge effekten af hinanden og dermed give en lovende løsning til GBM-behandling.

Selv om der er mange måder at evaluere narkotika-drug interaktioner af et lægemiddel kombination, såsom CI (Combination Index), HSA (Højeste Enkelt Agent), og Bliss værdier, etc.^3,4, disse beregningsmetoder er normalt baseret på flere koncentration kombinationer. Faktisk kan disse metoder give bekræftende vurdering af interaktion mellem narkotika og narkotika, men kan være meget besværlige, hvis de anvendes i screening med høj overførselshastighed. For at forenkle processen blev der udviklet en screeningsarbejdsproces til hurtigt at identificere de potentielle lægemiddelkombinationer, der hæmmer væksten af GSC’er, der stammer fra kirurgiske biopsier af patient GBM. Et følsomhedsindeks (SI), der afspejler forskellen mellem den forventede kombinerede effekt, og den observerede kombinerede effekt blev indført i denne metode for at kvantificere den synergigivende virkning af hvert lægemiddel, så de potentielle kandidater let kan identificeres ved SI-ranglisten. I mellemtiden, denne protokol viser et eksempel skærm til at identificere de potentielle kandidater (r), der kan synergize anti-gliom effekt med temozolomide, den første linje kemoterapi for GBM behandling, blandt 20 små molekylære hæmmere.

Protocol

GBM prøve blev erhvervet fra en patient under en rutinemæssig operation efter at have indhentet fuldt informeret samtykke fra human forskning etiske udvalg af The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. 1. Isolation og kultur af patientafledte GSC’er Placer frisk kirurgisk resected glioblastoma væv i en 15 mL centrifuge rør fyldt med steril PBS og gemme vævet på isen indtil videre operation. Hakke GBM væv i ca 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjælp…

Representative Results

XG387-cellerne dannede neurosfærer i det kulturmedium, der er beskrevet i tabel 1, i en ultralav fastgørelsesplade med 6 brøndskultur eller en ikke-belagt plade5 (Figur 1A). For det første blev der udført en test for at kontrollere, om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-cellerne var proportional med cellenummeret. Som vist i figur 1Bsteg bio-luminescensintensiteten proportionalt med celletætheden og resultere…

Discussion

I denne undersøgelse blev der beskrevet en protokol, der kan anvendes til at identificere potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte GSC’er. I modsætning til standard synergi / additivity metriske model såsom Loewe, BLISS, eller HSA metoder, en enkel og hurtig arbejdsgang blev brugt, der ikke kræver et lægemiddel par, der skal kombineres ved flere koncentrationer i en fuld factorial måde som de traditionelle metoder. I denne arbejdsgang blev SI (følsomhedsindeks), som stammer fra en unde…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.