Summary

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

Published: March 28, 2021
doi:

Summary

신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.

Abstract

신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.

Introduction

교모세포종 (GBM)은 1 차적인 뇌종양의 가장 일반적이고 공격적인 모형입니다. 현재, 최대 치료를받은 GBM 환자의 전반적인 생존 (수술의 조합, 화학 요법, 방사선 요법) 여전히 15 개월 보다 짧습니다. 따라서 GBM에 대한 새롭고 효과적인 치료가 시급히 필요합니다.

GBM에서 신경교종 줄기 세포(GSC)의 존재는 이러한 줄기와 같은 세포가 종양 미세 환경, 약물 내성 및 종양 재발1의유지에 피벗 역할을 하기 때문에 종래의 치료에 상당한 도전을 구성한다. 따라서 GSC를 타겟팅하는 것은 GBM 치료2에대한 유망한 전략이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 GBM의 약물 효능에 대한 주요 단점은 유전적 돌연변이, 혼합 된 아류형, 후성 유전학 조절 및 종양 미세 환경의 차이를 포함하되 이질유전학적 특성으로 치료에 매우 내화됩니다. 많은 실패한 임상 시험 후에, 과학자및 임상 연구원은 단 하나 에이전트 표적으로 한 치료가 GBM와 같은 고이질암의 진행을 완전히 통제할 수 없다는 것을 아마 실현했습니다. 반면, 엄선된 약물 조합은 서로의 효과를 시너지 효과 향상시킴으로써 그 효과를 승인하여 GBM 치료에 대한 유망한 솔루션을 제공한다.

CI(조합 지수), HSA(최고 단일제제), 블리스 값 등과 같은 약물 조합의 약물 상호작용을 평가하는방법은 여러 가지가있지만,이러한 계산 방법은 일반적으로 다중 농도 조합을 기반으로 한다. 실제로, 이러한 방법은 약물-약물 상호 작용의 긍정적인 평가를 제공할 수 있지만 높은 처리량 스크리닝에 적용되는 경우 매우 힘들 수 있습니다. 이 과정을 단순화하기 위해 환자 GBM의 외과 생검에서 비롯된 GSC의 성장을 저해하는 잠재적 약물 조합을 신속하게 식별하기 위한 스크리닝 워크플로우가 개발되었습니다. 예상 결합 효과의 차이를 반영하는 감도 지수(SI)는 각 약물의 시너지 효과를 정량화하기 위해 이 방법으로 도입되어 잠재적 후보자를 SI 랭킹에 의해 쉽게 식별할 수 있다. 한편, 본 프로토콜은 20개의 작은 분자 억제제 중 GBM 처리를 위한 일선 화학요법인 테모졸로미드와 항 신경교종 효과를 시너지시킬 수 있는 잠재적 후보(들)를 식별하는 예시 스크린을 보여줍니다.

Protocol

GBM 표본은 난징의과대학 제1부속병원의 인간연구윤리위원회의 완전한 동의를 얻은 후 일상적인 수술 중 환자로부터 취득되었다. 1. 환자 유래 GSC의 격리 및 문화 멸균 PBS로 채워진 15mL 원심분리기 튜브에 신선한 외과 적 절제 된 교모세포종 조직을 놓고 추가 수술이 있을 때까지 조직을 얼음에 저장하십시오. GBM 조직을 해부 가위를 사용하여 직경 약 0.5~1mm 조각?…

Representative Results

XG387 세포는 극저부착 6-웰 배양플레이트 또는 비코팅 플레이트5(도 1A)에서 표 1에 기재된 배양 배지에서 신경구를 형성하였다. 먼저, XG387-Luc 세포로부터의 생체 발광 강도가 세포 수에 비례했는지 여부를 확인하기 위한 테스트를 수행하였다. 도 1B에도시된 바와 같이, 바이오 발광 강도는 세포 밀도에 비례하여 증가하고 ?…

Discussion

본 연구에서는, 환자 유래 GSC를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하기 위해 적용될 수 있는 프로토콜이 설명되었다. Loewe, BLISS 또는 HSA 방법과 같은 표준 시너지/첨가도 메트릭 모델과 달리, 기존의 방법으로서 약물 쌍을 여러 농도로 결합할 필요가 없는 간단하고 빠른 워크플로우가 사용되었습니다. 이러한 워크플로우에서, 작은 분자 억제제와 함께 siRNAs의 감광 효과를 평가하는 연?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

중국 국립자연과학재단(81672962), 장쑤성 혁신팀 프로그램 재단, 동남아시아대학교 공동핵심사업재단, 난징의과대학 공동지원에 감사드립니다.

Materials

B-27 Gibco 17504-044 50X
EGF Gibco PHG0313 20 ng/ml
FGF Gibco PHG0263 20 ng/ml
Gluta Max Gibco 35050061 100X
Neurobasal Gibco 21103049 1X
Penicillin-Streptomycin HyClone SV30010 P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate Gibco 2088876 100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.  
ABT-737 MCE Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775) MCE Wee1 inhibitor
Axitinib MCE Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991 MCE Mcl-1 inhibitor
A 83-01 MCE Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380 Selleck Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235) Selleck Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib MCE Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib MCE EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib MCE EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib MCE Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib MCE Inhibitor of c-Kit
ML141 Selleck Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase 
OSI-930 MCE Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R 
Palbociclib MCE Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190 MCE Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155) MCE Survivin inhibitor
TCS 359 Selleck Potent FLT3 inhibitor
UMI-77 MCE Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) Selleck Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.

References

  1. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  2. Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
  3. Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
  4. Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
  5. Shi, Y., et al. Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance. Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).
  6. Tan, X., et al. Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV. Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).
  7. Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).
  8. Malyutina, A., et al. Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer. PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).
  9. He, L., et al. Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring. Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).
  10. Chen, C., et al. Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).

Play Video

Cite This Article
Hu, Z., Zhou, T., Wu, F., Lin, F. A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62312, doi:10.3791/62312 (2021).

View Video