En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

Summary

Glioma stamceller (GSC) er en liten brøkdel av kreftceller som spiller viktige roller i tumorinitiering, angiogenese og legemiddelresistens i glioblastom (GBM), den mest utbredte og ødeleggende primære hjernesvulsten. Tilstedeværelsen av GSC-er gjør GBM svært ildfast for de fleste individuelle målrettede midler, så det kreves screeningmetoder med høy gjennomstrømning for å identifisere potensielle effektive kombinasjonsterapeutiske midler. Protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt for å muliggjøre rask screening for potensiell kombinasjonsterapi med synergistisk interaksjon. De generelle trinnene i denne arbeidsflyten består i å etablere luciferase-taggede GSC-er, forberede matrigelbelagte plater, kombinere legemiddelscreening, analysere og validere resultatene.

Abstract

Glioma stamceller (GSC) er en liten brøkdel av kreftceller som spiller viktige roller i tumorinitiering, angiogenese og legemiddelresistens i glioblastom (GBM), den mest utbredte og ødeleggende primære hjernesvulsten. Tilstedeværelsen av GSC-er gjør GBM svært ildfast for de fleste individuelle målrettede midler, så det kreves screeningmetoder med høy gjennomstrømning for å identifisere potensielle effektive kombinasjonsterapeutiske midler. Protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt for å muliggjøre rask screening for potensiell kombinasjonsterapi med synergistisk interaksjon. De generelle trinnene i denne arbeidsflyten består i å etablere luciferase-taggede GSC-er, forberede matrigelbelagte plater, kombinere legemiddelscreening, analysere og validere resultatene.

Introduction

Glioblastom (GBM) er den vanligste og aggressive typen primær hjernesvulst. For tiden er den totale overlevelsen til GBM-pasienter som fikk maksimal behandling (en kombinasjon av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling) fortsatt kortere enn 15 måneder; så nye og effektive terapier for GBM er presserende nødvendig.

Tilstedeværelsen av glioma stamceller (GSC) i GBM utgjør en betydelig utfordring for den konvensjonelle behandlingen, da disse stamcellene spiller pivotroller i vedlikehold av tumormikromiljø, legemiddelresistens og tumorrescurrence¹. Derfor kan målretting av GSC-er være en lovende strategi for GBM-behandling². Likevel er en stor ulempe for legemiddeleffekten i GBM dens heterogenetiske natur, inkludert, men ikke begrenset til, forskjellen i genetiske mutasjoner, blandede undertyper, epigenetisk regulering og tumormikromiljø som gjør dem svært ildfaste for behandling. Etter mange mislykkede kliniske studier innså forskere og kliniske forskere at enkeltagent målrettet terapi sannsynligvis ikke er i stand til å kontrollere utviklingen av svært heterogene kreftformer som GBM. Mens nøye utvalgte legemiddelkombinasjoner har blitt godkjent for deres effektivitet ved synergistisk å forbedre effekten av hverandre, og dermed gi en lovende løsning for GBM-behandling.

Selv om det er mange måter å evaluere legemiddelinteraksjonene i en legemiddelkombinasjon, for eksempel CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) og Bliss-verdier, etc.^3,4, er disse beregningsmetodene vanligvis basert på flere konsentrasjonskombinasjoner. Faktisk kan disse metodene gi bekreftende vurdering av legemiddelinteraksjon, men kan være svært arbeidskrevende hvis de brukes i screening med høy gjennomstrømning. For å forenkle prosessen ble det utviklet en screeningarbeidsflyt for raskt å identifisere de potensielle legemiddelkombinasjonene som hemmer veksten av GSC-er fra kirurgiske biopsier av pasienten GBM. En sensitivitetsindeks (SI) som gjenspeiler forskjellen på forventet kombinert effekt og den observerte kombinerte effekten ble introdusert i denne metoden for å kvantifisere synergiserende effekten av hvert legemiddel, slik at potensielle kandidater lett kan identifiseres av SI-rangeringen. I mellomtiden demonstrerer denne protokollen et eksempelskjermbilde for å identifisere potensielle kandidater som kan synergisere anti-glioma-effekten med temozolomid, førstelinje kjemoterapi for GBM-behandling, blant 20 små molekylære hemmere.

Protocol

GBM-prøven ble anskaffet fra en pasient under en rutineoperasjon etter å ha fått fullt informert samtykke fra human forskningsetisk komité ved The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. 1. Isolasjon og kultur av pasientavledede GSC-er Legg ferskt kirurgisk resektert glioblastomvev i et 15 ml sentrifugerør fylt med steril PBS og oppbevar vevet på is inntil videre. Hakk GBM-vevet i omtrent 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjelp av disseksjonssaks og v…

Representative Results

XG387-cellene dannet nevrosfærer i kulturmediet beskrevet i tabell 1 i en ultra-lav feste 6-brønns kulturplate eller en ikke-belagt plate5 (Figur 1A). Først ble det utført en test for å sjekke om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-celler var proporsjonal med cellenummeret. Som vist i figur 1Bøkte bio-luminescensintensiteten proporsjonalt med celletettheten og resulterte i en lineær korreksjon mellom dem (Pea…

Discussion

I den nåværende studien ble det beskrevet en protokoll som kan anvendes for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved hjelp av pasientavledede GSC-er. I motsetning til standard synergy/additivity metrisk modell som Loewe, BLISS eller HSA metoder, ble det brukt en enkel og rask arbeidsflyt som ikke krever at et legemiddelpar kombineres ved flere konsentrasjoner på en full factorial måte som de tradisjonelle metodene. I denne arbeidsflyten ble SI (sensitivitetsindeks) som stammer fra en studie for å ev…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.