快速筛选工作流程，利用患者衍生胶质瘤干细胞确定GBM的潜在组合疗法

Summary

胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。

Abstract

胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。

Introduction

胶质母细胞瘤 （GBM） 是原发性脑肿瘤中最常见和最具有攻击性的类型。目前，接受最大治疗（手术、化疗和放疗相结合）的GBM患者的总体存活期仍不足15个月：因此， 迫切需要新颖有效的 Gbm 疗法。

胶质瘤干细胞（GSC）在GBM中的存在对常规治疗构成相当大的挑战，因为这些干细胞在维持肿瘤微环境、耐药性和肿瘤复发¹方面起着枢轴作用。因此，针对GSC可能是GBM治疗²的一个有希望的战略。然而，GBM药物疗效的一个主要缺点是其异质性，包括但不限于基因突变、混合亚型、表观遗传调节和肿瘤微环境的差异，这使得它们对治疗非常耐火。经过多次失败的临床试验，科学家和临床研究人员意识到，单一药物靶向治疗可能无法完全控制高异质性癌症（如GBM）的进展。然而，经过精心挑选的药物组合通过协同提高彼此的效果，已批准其有效性，从而为GBM治疗提供了一个有希望的解决方案。

虽然有许多方法来评估药物组合的药物-药物相互作用，如CI（组合指数）、HSA（最高单一剂）和Bliss值等^3、4，但这些计算方法通常基于多个浓度组合。事实上，这些方法可以提供药物-药物相互作用的肯定评估，但如果应用于高通量筛查，可能会非常费力。为了简化这一过程，开发了一个筛选工作流程，用于快速识别抑制GCS生长的潜在药物组合，这些组合源自患者GBM的外科活检。该方法引入了反映预期组合效应和观察到的组合效应差异的灵敏度指数 （SI），以量化每种药物的协同效应，因此 SI 排名可以轻松识别潜在候选者。同时，本协议演示了一个示例屏幕，以识别在20种小分子抑制剂中，能够与特莫佐洛米德（GBM治疗的一线化疗）协同抗胶质瘤效应的潜在候选者。

Protocol

GBM标本是在获得南京医科大学第一附属医院人类研究伦理委员会的充分知情同意后，在一次常规手术中从患者身上采集的。 1. 患者衍生的GCS的隔离和文化 将新鲜手术切除的胶质母细胞瘤组织放入充满无菌 PBS 的 15 mL 离心机管中，并将组织储存在冰上，直到进一步手术。 使用解剖剪刀将GBM组织切成直径约0.5至1毫米的碎片，并用神经元基底介质清洗组织标本，以…

Representative Results

XG387细胞在表1中描述的培养基中形成神经球，在超低附件6井培养板或非涂层板5（图1A）中形成。首先，进行了一项测试，以检查XG387-Luc细胞的生物发光强度是否与细胞数成正比。如图1B所示，生物发光强度与细胞密度成正比增加，导致它们之间的线性校正（Pearson r = 0.9872;p <0.0001;图1C）。由于荧光素?…

Discussion

在本研究中，描述了一种可用于使用患者衍生的 GSC 确定 GBM 潜在组合疗法的协议。与标准协同/增殖性指标模型（如 Loewe、BLISS 或 HSA 方法）不同，使用了简单而快速的工作流程，不需要将药物对以全因子方式以全因子方式与传统方法以多个浓度组合。在此工作流中，引入SI（敏感性指数），该指数源于一项研究，以评估SIRNA与小分子抑制剂相结合的敏感效应，以量化两种小分子抑制剂的协同药物?…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.