Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

Summary

Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.

Abstract

Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.

Introduction

El glioblastoma (GBM) es el tipo más común y agresivo de tumor cerebral primario. Actualmente, la supervivencia general de los pacientes con GBM que recibieron tratamiento máximo (una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia) sigue siendo inferior a 15 meses; por lo que se necesitan urgentemente terapias novedosas y efectivas para la GBM.

La presencia de células madre de glioma (GSC) en GBM constituye un desafío considerable para el tratamiento convencional, ya que estas células madre desempeñan un papel de pivote en el mantenimiento del microambiente tumoral, la resistencia a los medicamentos y la recurrencia tumoral¹. Por lo tanto, dirigirse a las GSC podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de GBM². Sin embargo, un inconveniente importante para la eficacia del fármaco en GBM es su naturaleza heterogénea, que incluye, entre otros, la diferencia en mutaciones genéticas, subtipos mixtos, regulación epigenética y microambiente tumoral que los hace muy refractarios para el tratamiento. Después de muchos ensayos clínicos fallidos, los científicos e investigadores clínicos se dieron cuenta de que la terapia dirigida a un solo agente es probablemente incapaz de controlar completamente la progresión de cánceres altamente heterogéneos como el GBM. Considerando que, las combinaciones de medicamentos cuidadosamente seleccionadas han sido aprobadas por su efectividad al mejorar sinérgicamente el efecto de cada uno, proporcionando así una solución prometedora para el tratamiento de GBM.

Aunque hay muchas maneras de evaluar las interacciones fármaco-fármaco de una combinación de fármacos, como el CI (Índice de Combinación), HSA (Agente Único Más Alto) y los valores de Bliss, etc.^3,4, estos métodos de cálculo generalmente se basan en combinaciones de concentración múltiple. De hecho, estos métodos pueden proporcionar una evaluación afirmativa de la interacción fármaco-fármaco, pero pueden ser muy laboriosos si se aplican en el cribado de alto rendimiento. Para simplificar el proceso, se desarrolló un flujo de trabajo de detección para identificar rápidamente las posibles combinaciones de medicamentos que inhiben el crecimiento de GSC originadas a partir de biopsias quirúrgicas de GBM del paciente. Se introdujo en este método un índice de sensibilidad (SI) que refleja la diferencia entre el efecto combinado esperado y el efecto combinado observado para cuantificar el efecto sinérgico de cada fármaco, de modo que los candidatos potenciales puedan identificarse fácilmente mediante la clasificación SI. Mientras tanto, este protocolo demuestra un ejemplo de pantalla para identificar el candidato (s) potencial (s) que puede sinergizar el efecto anti-glioma con temozolomida, la quimioterapia de primera línea para el tratamiento de GBM, entre 20 pequeños inhibidores moleculares.

Protocol

La muestra de GBM se adquirió de un paciente durante una operación de rutina después de obtener el consentimiento plenamente informado del comité de ética de investigación humana del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing. 1. Aislamiento y cultivo de GSC derivadas de pacientes Coloque el tejido fresco de glioblastoma resecodo quirúrgicamente en un tubo centrífugo de 15 ml lleno de PBS estéril y almacene el tejido en hielo hasta la operación adicional….

Representative Results

Las células XG387 formaron neuroesferas en el medio de cultivo descrito en la Tabla 1 en una placa de cultivo de 6 pozos de unión ultra baja o una placa no recubierta5 (Figura 1A). En primer lugar, se realizó una prueba para comprobar si la intensidad de bioluminiscencia de las células XG387-Luc era proporcional al número de células. Como se muestra en la Figura 1B,la intensidad de la bioluminiscencia aumentó propo…

Discussion

En el presente estudio, se describió un protocolo que se puede aplicar para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando GSC derivadas del paciente. A diferencia del modelo métrico estándar de sinergia / adición, como los métodos Loewe, BLISS o HSA, se utilizó un flujo de trabajo simple y rápido que no requiere que un par de medicamentos se combine a múltiples concentraciones de manera factorial completa como los métodos tradicionales. En este flujo de trabajo, se introdujo el SI (índice de sen…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.