Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

Summary

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell’inizio del tumore, nell’angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Abstract

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell’inizio del tumore, nell’angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Introduction

Il glioblastoma (GBM) è il tipo più comune e aggressivo di tumore cerebrale primario. Attualmente, la sopravvivenza globale dei pazienti GBM che hanno ricevuto il massimo trattamento (una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia) è ancora inferiore a 15 mesi; quindi sono urgentemente necessarie terapie nuove ed efficaci per GBM.

La presenza di cellule staminali di glioma (GSC) nel GBM costituisce una sfida considerevole per il trattamento convenzionale in quanto queste cellule staminali svolgono ruoli di perno nel mantenimento del microambiente tumorale, della resistenza ai farmaci e della recidiva tumorale¹. Pertanto, il targeting delle GSC potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento GBM². Tuttavia, un importante svantaggio per l’efficacia del farmaco in GBM è la sua natura eterogenetica, inclusa ma non limitata alla differenza di mutazioni genetiche, sottotipi misti, regolazione epigenetica e microambiente tumorale che li rende molto refrattari per il trattamento. Dopo molti studi clinici falliti, scienziati e ricercatori clinici si sono resi conto che la terapia mirata a singolo agente è probabilmente incapace di controllare completamente la progressione di tumori altamente eterogenei come il GBM. Considerando che, combinazioni di farmaci accuratamente selezionate sono state approvate per la loro efficacia migliorando sinergicamente l’effetto l’una dell’altra, fornendo così una soluzione promettente per il trattamento GBM.

Sebbene ci siano molti modi per valutare le interazioni farmaco-farmaco di una combinazione di farmaci, come i valori CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) e Bliss, ecc. 3^,4, questi metodi di^calcolosono solitamente basati su combinazioni di concentrazione multiple. In effetti, questi metodi possono fornire una valutazione affermativa dell’interazione farmaco-farmaco, ma possono essere molto laboriosi se applicati nello screening ad alto rendimento. Per semplificare il processo, è stato sviluppato un flusso di lavoro di screening per identificare rapidamente le potenziali combinazioni di farmaci che inibiscono la crescita delle GSC originate da biopsie chirurgiche del paziente GBM. Un indice di sensibilità (SI) che riflette la differenza tra l’effetto combinato atteso e l’effetto combinato osservato è stato introdotto in questo metodo per quantificare l’effetto sinergizzante di ciascun farmaco, in modo che i potenziali candidati possano essere facilmente identificati dalla classifica SI. Nel frattempo, questo protocollo dimostra uno screening di esempio per identificare i potenziali candidati che possono sinergizzare l’effetto anti-glioma con temozolomide, la chemioterapia di prima linea per il trattamento GBM, tra 20 piccoli inibitori molecolari.

Protocol

Il campione gbM è stato acquisito da un paziente durante un’operazione di routine dopo aver ottenuto il consenso pienamente informato dal comitato etico della ricerca umana del primo ospedale affiliato dell’Università di Medicina di Nanchino. 1. Isolamento e coltura delle GSC derivate dal paziente Posizionare il tessuto di glioblastoma fresco resecato chirurgicamente in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PBS sterile e conservare il tessuto sul ghiaccio fino a un’ulteriore …

Representative Results

Le cellule XG387 hanno formato neurosfere nel terreno di coltura descritto nella Tabella 1 in una piastra di coltura a 6 pozzetti di attacco ultra-basso o in una piastra non rivestita5 (Figura 1A). In primo luogo, è stato eseguito un test per verificare se l’intensità di bioluminescenza delle cellule XG387-Luc fosse proporzionale al numero di cellule. Come mostrato in Figura 1B,l’intensità della bioluminescenza è aume…

Discussion

Nel presente studio, è stato descritto un protocollo che può essere applicato per identificare potenziali terapie di combinazione per GBM utilizzando GSC derivate dal paziente. A differenza del modello metrico standard di sinergia / additività come i metodi Loewe, BLISS o HSA, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplice e rapido che non richiede che una coppia di farmaci sia combinata a concentrazioni multiple in modo fattoriale completo come i metodi tradizionali. In questo flusso di lavoro, SI (indice di sensib…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.