В этом отчете описываются методы выделения и очистки сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) из биологических образцов и подход электрофореза полиакриламидного геля для приближения их размера. ГАГ способствуют структуре тканей и влияют на сигнальные процессы посредством электростатического взаимодействия с белками. Длина полимера GAG способствует их сродству связыванию с родственными лигандами.
Сульфатированные гликозаминогликаны (GAGs), такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), повсеместно распространены в живых организмах и играют решающую роль в различных основных биологических структурах и процессах. В качестве полимеров GAG существуют в виде полидисперсной смеси, содержащей полисахаридные цепи, которые могут варьироваться от 4000 Да до более 40 000 Да. Внутри этих цепей существуют домены сульфатации, приделяющие паттерн отрицательного заряда, который облегчает взаимодействие с положительно заряженными остатками родственных белковых лигандов. Сульфатированные домены ГАГ должны быть достаточной длины, чтобы обеспечить эти электростатические взаимодействия. Чтобы понять функцию ГАГ в биологических тканях, исследователь должен быть в состоянии изолировать, очистить и измерить размер ГАГ. В этом отчете описывается практический и универсальный метод электрофореза на основе полиакриламидного геля, который может быть использован для устранения относительно небольших различий в размерах между GAG, выделенными из различных типов биологических тканей.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой разнообразное семейство линейных полисахаридов, которые являются повсеместным элементом в живых организмах и способствуют многим основным физиологическим процессам1. ГАГ, такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), могут быть сульфатированы в различных положениях вдоль полисахаридной цепи, придав географическим доменам отрицательный заряд. Эти GAG, будучи привязанными к белкам клеточной поверхности, известным как протеогликаны, проецируются во внеклеточное пространство и связываются с родственными лигандами, что позволяет регуляцию как цис- (лиганд, прикрепленный к одной и той же клетке), так и транс- (лиганд, прикрепленный к соседней клетке) сигнальных процессов2. Кроме того, ГАГ также выполняют решающую роль в качестве структурных элементов в тканях, таких как клубочковая базальная мембрана3,сосудистый эндотелиальный гликокаликс4 и легочный эпителиальный гликокаликс5,а также в соединительных тканях, таких как хрящ6.
Длина полисахаридных цепей GAG существенно варьируется в зависимости от ее биологического контекста и может динамически удлигаться, расщепляться и модифицироваться очень сложной ферментативной регуляторной системой7. Важно отметить, что длина полимерных цепей GAG существенно способствует их сродству связывания к лигандам и, впоследствии, их биологической функции8,9. По этой причине определение функции эндогенной ГАГ требует оценки ее размера. К сожалению, в отличие от белков и нуклеиновых кислот, существует очень мало легкодоступных методов обнаружения и измерения ГАГ, что исторически привело к относительно ограниченному исследованию биологических ролей этого разнообразного семейства полисахаридов.
В этой статье описывается, как изолировать и очищать ГАГ из большинства биологических тканей, а также описывается, как использовать электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) для оценки длины выделенных полимеров с достаточной степенью специфичности. В отличие от других, очень сложных (и часто основанных на масс-спектрометрии) гликомических подходов, этот метод может быть использован с использованием стандартного лабораторного оборудования и методов. Таким образом, этот практический подход может расширить возможности исследователей по определению биологической роли нативных ГАГ и их взаимодействия с контекстуально важными лигандами.
ГАГ играют центральную роль во многих разнообразных биологических процессах. Одной из основных функций сульфатированных GAG (таких как HS и CS) является взаимодействие с лигандами и связывание с них, которые могут изменять последующие сигнальные функции. Важным фактором, определяющим сро…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL и EPS)
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |