تحليل تكوين الدهون من البكتيريا الفطرية من قبل طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا
Summary
يتم تقديم بروتوكول لاستخراج المحتوى الكلي للدهون من جدار الخلية من مجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية. وعلاوة على ذلك، يتم عرض بروتوكولات استخراج وتحليل أنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك. كما يتم توفير بروتوكول كروماتوغرافي طبقة رقيقة لرصد هذه المركبات البكتيرية mycobacterial.
Abstract
يمكن أن تختلف أنواع البكتيريا الفطرية عن بعضها البعض في معدل النمو ، ووجود التصبغ ، ومورفولوجيا المستعمرة المعروضة على الوسائط الصلبة ، بالإضافة إلى الخصائص الظاهرية الأخرى. ومع ذلك ، لديهم جميعا في الطابع المشترك الأكثر صلة من البكتيريا الفطرية : جدار الخلية فريدة من نوعها ومائية للغاية. تحتوي أنواع الميكوباكتيريا على مركب مرتبط بالغشاء التكافؤي يتضمن الأرابينوغالاكتان والببتيدوغليكان والسلاسل الطويلة من الأحماض الميكوليكية مع أنواع تختلف بين أنواع البكتيريا الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنتج البكتيريا الفطرية أيضا الدهون الموجودة، غير المرتبطة بشكل مشترك، على أسطح خلاياها، مثل phthiocerol dimycocerosates (PDIM)، الجليكوليبيدات الفينولية (PGL)، glycopeptidolipids (GPL)، أسيلترهالوس (AT)، أو المانوسيدات فوسفاتيل-إينوزيتول (PIM)، من بين أمور أخرى. ويعتبر بعضها عوامل الفوعة في البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض، أو الدهون المضادة للجينات الحرجة في التفاعل بين البكتيريا الفطرية المضيفة. لهذه الأسباب ، هناك اهتمام كبير في دراسة الدهون الفطرية بسبب تطبيقها في العديد من المجالات ، من فهم دورها في مسببات الأمراض في عدوى البكتيريا الفطرية ، إلى تأثير محتمل كعوامل مناعية لعلاج الأمراض المعدية وغيرها من الأمراض مثل السرطان. هنا ، يتم تقديم نهج بسيط لاستخراج وتحليل محتوى الدهون الكلي وتكوين حمض الميكوليك لخلايا البكتريا التي تزرع في وسط صلب باستخدام خليط من المذيبات العضوية. بمجرد الحصول على مستخلصات الدهون ، يتم إجراء الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) لمراقبة المركبات المستخرجة. يتم إجراء تجربة المثال مع أربعة بكتيريا مختلفة: بروماي Mycolicibacterium البيئية سريعة النمو و Mycolicibacterium fortuitum ، و Mycobacterium bovis Calmillus-Guérin (BCG) ، ومسبب الأمراض الانتهازي سريع النمو Mycobacterium abscessus ، مما يدل على أن الأساليب الموضحة في البروتوكول الحالي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية.
Introduction
Mycobacterium هو جنس الذي يضم الأنواع المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض، تتميز وجود جدار الخلية مسعور للغاية وغير منفذة التي شكلتها الدهون غريبة. على وجه التحديد، جدار الخلية الفطرية يحتوي على الأحماض الميكوليكية، وهي α الألكيل والأحماض الدهنية β هيدروكسي، التي α فرع ثابت في جميع الأحماض الميكوليكية (باستثناء طول) وسلسلة β، ودعا سلسلة meromycolate، هي سلسلة طويلة اليفيتكي التي قد تحتوي على مجموعات كيميائية وظيفية مختلفة وصفها جنبا إلى جنب مع الأدب (α، α،، ميثوكسي، κ-، الايبوكسي،، كاربوكسي-، وω-1-ميثوكسي-ميكولات)، وبالتالي إنتاج سبعة أنواع من الأحماض الميكوليك (I-VII)1. وعلاوة على ذلك، الدهون الأخرى ذات أهمية لا يرقى إليها الشك موجودة أيضا في جدار الخلية من الأنواع المتفطرة. الأنواع المسببة للأمراض مثل Mycobacterium tuberculosis, العامل المسبب لمرض السل2 إنتاج عوامل محددة للفوعة القائمة على الدهون مثل ديميكوسيروسات phthiocerol (PDIMs)، الجليكوليبيد الفينولية (PGL)، دي، ثلاثي، وبينتا أسيلترهالوس (DAT، TAT، وبات)، أو sulfolipids، من بين أمور أخرى3. وقد ارتبط وجودها على سطح البكتيريا الفطرية مع القدرة على تعديل الاستجابة المناعية المضيف، وبالتالي، تطور واستمرار البكتيريا الفطرية داخل المضيف4. على سبيل المثال ، ارتبط وجود triacylglycerols (TAG) مع النمط الظاهري المفرط للفيروسات من النسب الفرعي 2 – بكين من M. tuberculosis, ربما بسبب قدرتها على توهين الاستجابة المناعية المضيف5,6. الدهون الأخرى ذات الصلة هي lipooligosaccharides (LOSs) موجودة في البكتيريا الفطرية السل وغير المسببة للركل. في حالة Mycobacterium marinum، يرتبط وجود LOSs في جدار الخلية الخاص به بحركية انزلاقية والقدرة على تشكيل الأغشية الحيوية ويتداخل مع التعرف عليه من قبل مستقبلات التعرف على نمط الضامة ، مما يؤثر على امتصاص والقضاء على البكتيريا عن طريق الخلايا الفواجية المضيفة7,8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن غياب أو وجود بعض الدهون يسمح لأعضاء من نفس النوع بتصنيفهم إلى أنواع مورفوتية مختلفة مع ملامح خبيثة أو مخففة عند التفاعل مع الخلايا المضيفة. على سبيل المثال، غياب الجليكوبيدوليبيدات (GPL) في شكل مورفو نوع الخام من Mycobacterium abscessus وقد ارتبط مع القدرة على الحث على تحمض داخل الphagosomal، وبالتالي موت الخلايا المبرمج9، على عكس النمط المورفوتيب السلس الذي يمتلك ال جي بي ال في سطحه. وعلاوة على ذلك، يرتبط محتوى الدهون من جدار الخلية البكتيرية إلى القدرة على تعديل الاستجابة المناعية في المضيف. هذا هو ذات الصلة في سياق استخدام بعض البكتيريا الفطرية لتحريك ملف المناعة واقية ضد أمراض مختلفة10,11,12,13. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن Mycolicibacterium vaccae، و mycobacterium saprophytic ، الذي هو حاليا في المرحلة الثالثة التجارب السريرية كلقاح العلاج المناعي لمرض السل ، وعرض اثنين من الأنواع المورفولوجية الاستعمارية. في حين أن النمط الظاهري السلس ، الذي يحتوي على البوليستر في سطحه ، يؤدي إلى استجابة Th2 ، فإن النمط الظاهري الخام الخالي من البوليستر يمكن أن يحفز ملف Th1 عندما يتفاعل مع الخلايا المناعية المضيفة14. ذخيرة من الدهون الموجودة في الخلية الفطرية لا يعتمد فقط على الأنواع المتفطرة، ولكن أيضا على ظروف الثقافات الفطرية: وقت الحضانة15,16 أو تكوين الوسط الثقافي17,18. في الواقع ، تؤثر التغيرات في التركيبة المتوسطة للثقافة على النشاط المضاد للمناعة والمناعة M. bovis BCG و Mycolicibacterium brumae in vitro17. وعلاوة على ذلك، فإن الشخصية المناعية الواقية الناجمة عن M. bovis BCG ضد M. tuberculosis التحدي في نماذج الفئران يعتمد أيضا على وسائل الإعلام الثقافية التي M. bovis BCG ينمو17. ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه ذات صلة لتكوين الدهون من البكتيريا الفطرية في كل حالة الثقافة. لجميع هذه الأسباب ، فإن دراسة محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية ذات الصلة. يتم تقديم إجراء بصري لاستخراج وتحليل تكوين الدهون من جدار الخلية البكتيرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم بروتوكول بسيط يعتبر الطريقة القياسية الذهبية لاستخراج مركبات الدهون غير المرتبطة بشكل غير مكافئ من جدار الخلية البكتيرية mycobacterial. يظهر مزيد من التصور من قبل TLCs أحادية واثنين الأبعاد من الدهون المستخرجة من أربعة بكتيريا مختلفة.
خليطين متتاليين من الكلوروفورم وال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (RTI2018-098777-B-I00) وصناديق FEDER و Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). ساندرا غوالار غاريدو حاصلة على عقد دكتوراه من جنرال كاتالونيا.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
