Analyse de la composition lipidique des mycobactéries par chromatographie sur couche mince
Summary
Un protocole est présenté pour extraire la teneur totale en lipides de la paroi cellulaire d’un large éventail de mycobactéries. De plus, les protocoles d’extraction et d’analyse des différents types d’acides mycoliques sont présentés. Un protocole chromatographique sur couche mince pour surveiller ces composés mycobactériens est également fourni.
Abstract
Les espèces de mycobactéries peuvent différer les unes des autres par le taux de croissance, la présence de pigmentation, la morphologie de la colonie affichée sur les milieux solides, ainsi que d’autres caractéristiques phénotypiques. Cependant, ils ont tous en commun le caractère le plus pertinent des mycobactéries: sa paroi cellulaire unique et hautement hydrophobe. Les espèces de mycobactéries contiennent un complexe membranaire-covalent qui comprend l’arabinogalactane, le peptidoglycane et de longues chaînes d’acides mycoliques avec des types qui diffèrent entre les espèces de mycobactéries. En outre, les mycobactéries peuvent également produire des lipides situés, non liés de manière covalente, à la surface de leurs cellules, tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les glycopeptidolipides (GPL), les acyltréhaloses (AT) ou les mannosides de phosphatidil-inositol (PIM), entre autres. Certains d’entre eux sont considérés comme des facteurs de virulence dans les mycobactéries pathogènes, ou des lipides antigéniques critiques dans l’interaction hôte-mycobactéries. Pour ces raisons, il existe un intérêt significatif pour l’étude des lipides mycobactériens en raison de leur application dans plusieurs domaines, de la compréhension de leur rôle dans la pathogénicité des infections à mycobactéries, à une implication possible en tant qu’agents immunomodulateurs pour le traitement des maladies infectieuses et d’autres pathologies telles que le cancer. Ici, une approche simple pour extraire et analyser la teneur totale en lipides et la composition en acide mycolique des cellules de mycobactéries cultivées dans un milieu solide à l’aide de mélanges de solvants organiques est présentée. Une fois les extraits lipidiques obtenus, une chromatographie sur couche mince (TLC) est effectuée pour surveiller les composés extraits. L’exemple d’expérience est réalisé avec quatre mycobactéries différentes: mycolicibacterium brumae et Mycolicibacterium fortuitum, mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), à croissance lente atténuée, et Mycobacterium abcessus ,un pathogène opportuniste à croissance rapide, démontrant que les méthodes présentées dans le présent protocole peuvent être utilisées pour un large éventail de mycobactéries.
Introduction
Mycobacterium est un genre qui comprend des espèces pathogènes et non pathogènes, caractérisées par une paroi cellulaire hautement hydrophobe et imperméable formée par leurs lipides particuliers. Plus précisément, la paroi cellulaire mycobactérienne contient des acides mycoliques, qui sont des acides gras α-alkyle et β-hydroxy, dans lesquels la branche α est constante dans tous les acides mycoliques (à l’exception de la longueur) et la chaîne β, appelée chaîne méroromycolate, est une longue chaîne aliphatique qui peut contenir différents groupes chimiques fonctionnels décrits avec la littérature (α-, α’-, méthoxy-, Mycolates κ-, époxy-, carboxy- et ω-1-méthoxy-), produisant donc sept types d’acides mycoliques (I-VII)1. De plus, d’autres lipides d’une importance incontestable sont également présents dans la paroi cellulaire des espèces de mycobactéries. Espèces pathogènes telles que Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose2 produire des facteurs de virulence spécifiques à base de lipides tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les di-, tri- et penta-acyltréhaloses (DAT, TAT et PAT), ou les sulfolipides, entre autres3. Leur présence sur la surface mycobactérielle a été associée à la capacité de modifier la réponse immunitaire de l’hôte et, par conséquent, à l’évolution et à la persistance de la mycobactérie à l’intérieur de l’hôte.4. Par exemple, la présence de triacylglycérols (TAG) a été associée au phénotype hypervirulent de la sous-lignée 2-Beijing de M. tuberculosis, peut-être en raison de sa capacité à atténuer la réponse immunitaire de l’hôte5,6. D’autres lipides pertinents sont les lipooligosaccharides (LS) présents dans les mycobactéries tuberculeuses et non tuberculeuses. Dans le cas de Mycobacterium marinum, la présence de LS dans sa paroi cellulaire est liée à la motilité glissante et à la capacité de former des biofilms et interfère avec la reconnaissance par les récepteurs de reconnaissance des formes de macrophages, affectant l’absorption et l’élimination des bactéries par les phagocytes hôtes7,8. De plus, l’absence ou la présence de certains lipides permet aux membres d’une même espèce d’être classés en différents morphotypes avec des profils virulents ou atténués lorsqu’ils interagissent avec les cellules hôtes. Par exemple, l’absence de glycopeptidolipides (GPL) dans le morphotype approximatif de Mycobacterium abscessus a été associé à la capacité d’induire une acidification intraphagosomale et, par conséquent, une apoptose cellulaire9, contrairement au morphotype lisse qui possède des GPG à leur surface. De plus, la teneur en lipides de la paroi cellulaire mycobactérielle est liée à la capacité de modifier la réponse immunitaire chez l’hôte. Ceci est pertinent dans le contexte de l’utilisation de certaines mycobactéries pour déclencher un profil immunitaire protecteur contre différentes pathologies10,11,12,13. Il a été démontré, par exemple, que Mycolicibacterium vaccae, une mycobactérie saprophyte, qui fait actuellement l’objet d’essais cliniques de phase III en tant que vaccin immunothérapeutique contre la tuberculose, présente deux morphotypes coloniaux. Alors que le phénotype lisse, qui contient un polyester à sa surface, déclenche une réponse Th2, le phénotype rugueux dépourvu de polyester peut induire un profil Th1 lorsqu’il interagit avec les cellules immunitaires de l’hôte.14. Le répertoire des lipides présents dans la cellule mycobactérielle dépend non seulement des espèces de mycobactéries, mais aussi des conditions des cultures mycobactériennes: temps d’incubation15,16 ou la composition du milieu de culture17,18. En fait, les changements dans la composition du milieu de culture affectent l’activité antitumorale et immunostimulante de M. bovis BCG et Mycolicibacterium brumae in vitro17. De plus, le profil immunitaire protecteur déclenché par M. bovis BCG contre M. tuberculosis le défi dans les modèles de souris dépend également du milieu de culture dans lequel M. bovis Le BCG se développe17. Ceux-ci pourraient alors être liés à la composition lipidique des mycobactéries dans chaque condition de culture. Pour toutes ces raisons, l’étude de la teneur en lipides des mycobactéries est pertinente. Une procédure visuelle pour extraire et analyser la composition lipidique de la paroi cellulaire mycobactérienne est présentée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole simple considéré comme la méthode de référence pour l’extraction de composés lipidiques non liés par cocovalence de la paroi cellulaire mycobactérielle est présenté. Une visualisation plus poussée par des TLC unidimensionnels et bidimensionnels à partir des lipides extraits de quatre mycobactéries différentes est montrée.
Deuxmélanges combinés consécutifs de chloroforme et de méthanol pour récupérer la teneur lipidique des cellules mycobactérienn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités (RTI2018-098777-B-I00), les Fonds FEDER et la Generalitat de Catalogne (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido est titulaire d’un contrat de doctorat (FI) de la Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
