Analys av lipidsammansättningen av mykobakterier genom tunnskiktsk kromatografi
Summary
Ett protokoll presenteras för att extrahera det totala lipidinnehållet i cellväggen i ett brett spektrum av mykobakterier. Dessutom visas extraktions- och analysprotokoll för de olika typerna av mykolicsyror. Ett kromatografiskt protokoll i tunt lager för att övervaka dessa mykobakteriella föreningar tillhandahålls också.
Abstract
Mykobakterier kan skilja sig från varandra i tillväxthastighet, närvaro av pigmentering, kolonimorfologin som visas på fasta medier, liksom andra fenotypiska egenskaper. Men de har alla gemensamt den mest relevanta karaktären av mykobakterier: dess unika och mycket hydrofobiska cellvägg. Mykobakterier innehåller ett membrankovalent länkat komplex som innehåller arabinogalactan, peptidoglykan och långa kedjor av mykolicsyror med typer som skiljer sig mellan mykobakterier. Dessutom kan mykobakterier också producera lipider som är belägna, icke-kovalent kopplade, på deras cellytor, såsom fothiocerol dimycocerosates (PDIM), fenollykolpolider (PGL), glykopeptidolipids (GPL), akryltrehaloser (AT) eller fosfatidil-inositol mannosides (PIM), bland andra. Vissa av dem anses vara virulensfaktorer i patogena mykobakterier, eller kritiska antigena lipider i värd-mycobacteria interaktion. Av dessa skäl finns det ett betydande intresse för studier av mykobakteriella lipider på grund av deras tillämpning inom flera områden, från att förstå deras roll i patogeniciteten av mykobakteriinfektioner, till en möjlig implikation som immunmodulerande medel för behandling av infektionssjukdomar och andra patologier som cancer. Här presenteras ett enkelt tillvägagångssätt för att extrahera och analysera det totala lipidinnehållet och mykolicsyrasammansättningen av mykobaktericeller som odlas i ett fast medium med blandningar av organiska lösningsmedel. När lipidextrakten har erhållits utförs tunnskiktskromatografi (TLC) för att övervaka de extraherade föreningarna. Exempelexperimentet utförs med fyra olika mykobakterier: den miljösnabba Mycolicibacterium brumae och Mycolicibacterium fortuitum, den försvagade långsamt växande Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) och den opportunistiska patogenen snabbväxande Mycobacterium abscessus, vilket visar att metoder som visas i detta protokoll kan användas till ett brett spektrum av mykobakterier.
Introduction
Mycobacterium är ett släkte som består av patogena och icke-patogena arter, kännetecknad av att ha en mycket hydrofobisk och ogenomtränglig cellvägg som bildas av deras säregna lipider. Specifikt innehåller mykobakteriella cellväggen mykolicsyror, α-alkyl- och β hydroxifettsyror, där α-grenen är konstant i alla mykolicsyror (med undantag för längden) och β-kedjan, kallad meromycolatekedjan, är en lång alifatisk kedja som kan innehålla olika funktionella kemiska grupper som beskrivs tillsammans med litteraturen (α-, α’-, metoxi-, κ-, epoxi-, karboxyr- och ω-1-methoxy- mykolater), vilket producerar sju typer av mykolicsyror (I-VII)1. Dessutom finns andra lipider med obestridlig betydelse också i cellväggen hos mykobakterier. Patogena arter som Mycobacterium tuberculosis, orsaksmedlet för tuberkulos2 producera specifika lipidbaserade virulensfaktorer såsom phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolisk glykolpid (PGL), di-, tri- och penta-acyltrehaloser (DAT, TAT och PAT), eller sulfolipids, bland andra3. Deras närvaro på mykobakteriella ytan har associerats med förmågan att modifiera värdens immunsvar och därför utvecklingen och persistensen av mykobakteriet inuti värden4. Förekomsten av triacylglyceroler (TAG) har till exempel associerats med den hypervirulenta fenotypen av härstamning 2-Peking-under härstamning av M. tuberculosis, möjligen på grund av dess förmåga att dämpa värdens immunsvar5,6. Andra relevanta lipider är lipooligosackarider (LOSs) som förekommer i tuberkulös och icke-skrupelfri mykobakterier. När det gäller Mycobacterium marinum, är närvaron av LOSs i sin cellvägg relaterad till glidande motilitet och förmågan att bilda biofilmer och stör igenkänning av makrofagmönsterigenkänningsreceptorer, vilket påverkar upptag och eliminering av bakterierna genom värdfostcyter7,8. Dessutom tillåter frånvaron eller närvaron av vissa lipider medlemmar av samma art att klassificeras i olika morfotyper med virulenta eller dämpa profiler när de interagerar med värdceller. Till exempel frånvaron av glykopeptidolipids (GPL) i den grova morfotypen av Mycobacterium abscessus har associerats med förmågan att inducera intraphagosomal försurning, och följaktligen cell apoptos9, till skillnad från den släta morfotypen som har GPLs i deras yta. Dessutom är lipidinnehållet i mykobakteriella cellväggen relaterat till förmågan att modifiera immunsvaret i värden. Detta är relevant i samband med att använda vissa mykobakterier för att utlösa en skyddande immunprofil mot olika patologier10,11,12,13. Det har till exempel visats att Mycolicibacterium vaccae, visar ett saprofytiskt mykobakterie, som för närvarande är i kliniska fas III-studier som ett immunoterapeutiskt vaccin mot tuberkulos, två koloniala morfotyper. Medan den släta fenotypen, som innehåller en polyester i ytan, utlöser ett Th2-svar, kan den grova fenotypen utan polyester inducera en Th1-profil när den interagerar med värd immunceller14. Repertoaren av lipider som finns i mykobakteriella cellen beror inte bara på mykobakterier, men också på villkoren för mykobakteriella kulturer: inkubationstid15,16 kulturmediets sammansättning eller sammansättning17,18. I själva verket påverkar förändringar i kulturens medelsammansättning antitumör- och immunstimulatorisk aktivitet hos M. bovis BCG och Mycolicibacterium brumae in vitro17. Dessutom kan den skyddande immunprofil som utlöses av M. bovis BCG mot M. tuberculosis utmaning i mössmodeller beror också på de kulturmedier där M. bovis BCG växer17. Dessa kan sedan relateras till lipidsammansättningen av mykobakterier i varje odlingsförhållande. Av alla dessa skäl är studien av lipidinnehållet i mykobakterier relevant. En visuell procedur för att extrahera och analysera lipid sammansättningen av mycobacterial cell väggen presenteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett enkelt protokoll som betraktas som guld standard metod för utvinning av icke-covalently länkade lipid föreningar från mycobacterial cell väggen presenteras. Ytterligare visualisering av en- och tvådimensionella TLCs från extraherade lipider av fyra olika mycobacteria visas.
Två på varandra följande kombinerade blandningar av kloroform och metanol för att återställa lipidhalten i mykobakteriella celler är den mest använda lösningsmedelsblandningen23,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet (RTI2018-098777-B-I00), FEDER-fonderna och Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido är mottagare av ett doktorandkontrakt (FI) från Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
