Summary

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

Published: October 20, 2021
doi:

Summary

B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.

Abstract

CD4 T 세포는 만성 B형 간염의 병인에 있는 중요한 역할을 합니다. 다목적 세포 집단으로서, CD4 T 세포는 분비한 사이토카인에 기초한 뚜렷한 기능성 하위 집합으로 분류되었습니다: 예를 들어, CD4 T 도우미 1 세포를 위한 IFN-γ, CD4 T 도우미 2 세포에 대한 IL-4 및 IL-13, CD4 T 여포 도우미 세포를 위한 IL-21 및 CD4 T 헬퍼 셀용 IL-17. HBV 유래 펩티드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한 B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD4 T 세포의 분석은 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기뿐만 아니라 HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능적 서브세트에 대한 정보를 제공할 수 있었다. 전사학 및 메타볼로믹스 분석과 같은 새로운 접근법은 HBV 특이적 CD4 T 세포에 대한 보다 상세한 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법은 일반적으로 펩타이드-주요 조직적합성 복합-II 멀티머를 기반으로 실행 가능한 HBV 특이적 CD4 T 세포의 격리가 필요하며, 현재 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프에 대한 정보는 제한적이다. HBV 유래 펩타이드 매트릭스를 기반으로, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 만성 HBV 감염 환자로부터 말초 혈액 단핵세포 샘플을 사용하여 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이 개발되었다.

Introduction

현재 항원 특이적 T 세포를 분석하는 3가지 주요 접근법이 있다. 첫 번째 접근법은 T 세포 수용체와 펩타이드 (epitope)사이의 상호 작용에 기초한다. 항원 특이적 T 세포는 펩티드-주요 조직적합성 복합체(MHC) 다중머로 직접 염색될 수 있다. 이 방법의 장점은 다운스트림 전사학/메타볼로믹스 분석에 적합한 실행 가능한 항원 특이적 T 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법의 한계는 특정 항원에 대한 전체 T 세포 반응에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것입니다, 특정 항원에 대한 확인된 에피토프의 수가 현재 제한되어 있는 동안 검증된 에피토프 펩티드가 필요하기 때문이다. B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD8 T 세포 에피토프에 비해, HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프가1,2로확인되어현재 HBV 특이CD4 T 세포의 분석에 덜 적용할 수 있게 되었다.

두 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극3후 일련의 활성화 유도 마커의 업레조절에 기초한다. 일반적으로 사용되는 마커는 CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4를포함한다. 이 방법은 현재 예방접종대상자5,6,인간 면역결핍 바이러스 감염 환자7,중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2감염환자8,9에서항원 특이적 T세포 반응을 분석하는 데 사용되어 왔다. 펩타이드-MHC 멀티머 기반 분석과 는 달리, 이 방법은 검증된 전형체에 의해 제한되지 않으며 다운스트림 분석을 위한 실행 가능한 세포를 얻을 수 있었다. 이 방법의 한계는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것이다. 또한, 일부 활성화된 항원 특이적 세포에 의한 이러한 활성화 유도 마커의 발현은 분석에서 배경 신호에 기여할 수 있으며, 이는 특히 표적 항원 특이적 T 세포가 드물 때 문제가 될 수 있다. 현재, HBV 특이CD4 T 셀4에대한 이 방법의 제한된 적용이 있다. 이 방법이 HBV 특이적 CD4 T 세포를 신뢰할 수 있는 방식으로 분석하기 위해 활용할 수 있는지 여부는 추가 조사가 필요합니다.

세 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한다. 활성화 유도 마커 기반 분석과 마찬가지로 이 방법은 검증된 전형에 의해 제한되지 않습니다. 이 방법은 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일을 직접 밝힐 수 있었다. 이 방법의 감도는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 분비에 의존하기 때문에 활성화 유도 마커 기반 방법보다 낮으며 테스트된 사이토카인의 수는 일반적으로 제한적이다. 현재, 이 방법은 HBV 특이적 T 세포의 분석에 널리 사용된다. HBV 특이적 T 세포를 분비하는 사이토카인은 직접 전 생체 펩타이드자극(10,11)에의해 거의 검출될 수 없기 때문에, HBV 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일은 보통 10일 후에 시험관내 펩타이드 자극 팽창팽창,13,14,15,16을분석한다. 매트릭스 형태로 펩티드 풀의 배열은 항원 특이적에피토프(17,18)의식별을 용이하게 하기 위해 활용되고 있다. 펩타이드 매트릭스와 사이토카인 분비 분석의 조합으로 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이개발되었다 16. 이 프로토콜에서는 이 메서드의 세부 정보가 설명되어 있습니다. HBV 코어 항원은 이 프로토콜에서 데모의 예로 선택된다.

Protocol

연구에 포함된 각 환자로부터 서면 통보 된 동의를 얻었다. 연구 프로토콜은 사우스 웨스트 병원의 의료 윤리위원회의 사전 승인에 반영된 1975 년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수합니다. 1. HBV 유래 펩타이드 매트릭스의 설계 NCBI 데이터베이스에서 HBV 코어 항원의 아미노산 서열을 다운로드합니다(GenBank: AFY98989.1). HBV 코어 항원 유래 펩티드(펩티드 합성 서비스 …

Representative Results

CD4 T 세포를 분비하는 사이토카인의 빈도는 단일 생산자와 이중 생산자 모두의 합으로 계산됩니다. 도 1에서입증된 바와 같이, TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 배경 제어(DMSO)에서 CD4 T 세포를 분비하는 IFN-γ 의 주파수는 각각 0.154% 및 0.013%이다. TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 펩타이드 풀 코어11에 특정 된 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 0.206 및 0.017, 그래서 TNF-α 분비 …

Discussion

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같이 나열됩니다: 1) PBMC 확장을 시작할 가능성이 높은 충분한 PBMC; 2) PBMC 확장에 적합한 환경; 및 3) 에피토프 식별 전에 PBMC 배양에서 잔류 펩티드 풀을 완전히 제거합니다.

이 프로토콜의 모든 분석은 CD4 T 셀의 강력한 증식에 따라 달라집니다. 일반적으로 10일 확장 후 PBMC 수는 초기 수의 2~3배입니다. 세포 수와 PBMC의 생존 가능성은…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81930061), 충칭자연과학재단(cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxxX0004), 중국키에 의해 지원되었습니다.
전염병 전문 프로젝트 (2018ZXX10723203).

Materials

Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

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Cite This Article
Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

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