Summary

Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы

Published: October 20, 2021
doi:

Summary

Основываясь на пептидной матрице, полученной из вируса гепатита В (HBV), HBV-специфические CD4 Т-клеточные ответы могут быть оценены параллельно с идентификацией HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов.

Abstract

CD4 Т-клетки играют важную роль в патогенезе хронического гепатита В. Как универсальная клеточная популяция, CD4 Т-клетки были классифицированы как отдельные функциональные подмножества на основе цитокинов, которые они секретировали: например, IFN-γ для CD4 T-хелперных клеток 1, IL-4 и IL-13 для CD4 T-хелперных клеток 2, IL-21 для CD4 T фолликулярных хелперных клеток и IL-17 для CD4 T хелперов 17 клеток. Анализ специфических CD4 Т-клеток вируса гепатита В (HBV) на основе секреции цитокинов после стимуляции пептидов, полученных из HBV, может предоставить информацию не только о величине HBV-специфического ответа CD4 T-клеток, но и о функциональных подмножествах HBV-специфических CD4 Т-клеток. Новые подходы, такие как транскриптомика и метаболомический анализ, могут предоставить более подробную функциональную информацию о HBV-специфических CD4 Т-клетках. Эти подходы обычно требуют выделения жизнеспособных HBV-специфических CD4 Т-клеток на основе пептидно-основных мультимеров гистосовместимости комплекса II, в то время как в настоящее время информация об HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопах ограничена. На основе пептидной матрицы, полученной из HBV, был разработан метод для оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно с использованием образцов мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.

Introduction

В настоящее время существует 3 основных подхода к анализу антиген-специфических Т-клеток. Первый подход основан на взаимодействии между Т-клеточным рецептором и пептидом (эпитопом). Антиген-специфические Т-клетки могут быть непосредственно окрашены мультимерами пептидно-большого комплекса гистосовместимости (MHC). Преимущество этого метода заключается в том, что он может получить жизнеспособные антиген-специфические Т-клетки, подходящие для последующего анализа транскриптомики / метаболомики. Ограничение этого метода заключается в том, что он не может предоставить информацию о реакции всей Т-клетки на специфический антиген, поскольку он требует проверенных эпитопных пептидов, в то время как количество идентифицированных эпитопов для конкретного антигена на данный момент ограничено. По сравнению с cd8-клеточными эпитопами CD8,специфичными для вируса гепатита В (HBV), было идентифицировано меньше HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов1,2,что сделало этот метод менее применимым для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток в настоящее время.

Второй подход основан на апрегуляции серии индуцированных активацией маркеров после стимуляции антигеннымпептидом 3. Обычно используемые маркеры включают CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Этот метод в настоящее время используется для анализа антиген-специфических Т-клеточных ответов у вакцинированных лиц5,6,пациентов с вирусной инфекцией иммунодефицита человека7и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 с инфекцией8,9. В отличие от мультимерного анализа на основе пептида-MHC, этот метод не ограничен валидируемыми эпитопами и может получить жизнеспособные клетки для последующего анализа. Ограничением этого метода является то, что он не может предоставить информацию о цитокиновом профиле антиген-специфических Т-клеток. Кроме того, экспрессия этих маркеров, индуцированных активацией, некоторыми активированными антиген-неспецифическими клетками может способствовать фоновым сигналам в анализе, что может быть проблемой, особенно когда целевые антиген-специфические Т-клетки редки. В настоящее время применение этого метода на HBV-специфических CD4 Т-клетках4ограничено. Может ли этот метод быть использован для надежного анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток, требует дальнейшего изучения.

Третий подход основан на секреции цитокинов после стимуляции антигенным пептидом. Как и анализ на основе маркеров, индуцированный активацией, этот метод не ограничен валидированными эпитопами. Этот метод может непосредственно выявить цитокиновый профиль антиген-специфических Т-клеток. Чувствительность этого метода ниже, чем метода, индуцированного активацией маркера, поскольку он опирается на секрецию цитокинов антиген-специфических Т-клеток, а количество тестируемых цитокинов обычно ограничено. В настоящее время этот метод широко используется при анализе HBV-специфических Т-клеток. Поскольку цитокины, секретируемые HBV-специфическими Т-клетками, вряд ли могут быть обнаружены путем прямой пептидной стимуляции ex vivo10,11,цитокиновый профиль HBV-специфических Т-клеток обычно анализируется после 10-дневного ин-витида in vitro, стимулированного расширением12,13,14,15,16. Расположение пептидных пулов в матричной форме было использовано для облегчения идентификации антиген-специфических эпитопов17,18. С комбинацией пептидной матрицы и анализа цитокиновой секреции был разработан метод оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно16. В этом протоколе подробно описаны данные метода. Основной антиген HBV выбран в качестве примера демонстрации в этом протоколе.

Protocol

Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента, включенного в исследование. Протокол исследования соответствует этическим принципам Хельсинкской декларации 1975 года, что отражено в априорном одобрении комитетом по медицинской этике Юго-Западной больницы. <p c…

Representative Results

Частота цитокинов, секретировывающих CD4 Т-клеток, рассчитывается как сумма как одиночных продуцентов, так и двойных продуцентов. Как показано на рисунке 1,частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток в фоновом контроле (DMSO) составляют 0,154…

Discussion

Наиболее важные шаги в этом протоколе перечислены следующим образом: 1) достаточное количество НБК высокой жизнеспособности для начала расширения НБК; 2) подходящая среда для расширения НБМК; и 3) полное удаление остаточных пептидных пулов в культуре PBMCs до идентификации эпитопа.

<p class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81930061), Фондом естественных наук Чунцина (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) и Китайским ключом.
Специализированный проект по инфекционным заболеваниям (2018ZX10723203).

Materials

Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Play Video

Cite This Article
Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

View Video