Baserat på en hepatit B-virus (HBV)-härledd peptidmatris kan HBV-specifika CD4 T-cellssvar utvärderas parallellt med identifiering av HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper.
CD4 T celler spelar viktiga roller i patogenesen vid kronisk hepatit B. Som en mångsidig cellpopulation har CD4 T-celler klassificerats som distinkta funktionella delmängder baserade på de cytokiner de utsöndrade: till exempel IFN-γ för CD4 T-hjälpare 1 celler, IL-4 och IL-13 för CD4 T-hjälpare 2 celler, IL-21 för CD4 T follikulära hjälpceller och IL-17 för CD4 T-hjälpare 17 celler. Analys av hepatit B-virus (HBV)-specifika CD4 T-celler baserade på cytokinutsöndring efter HBV- härledda peptider stimulering kunde ge information inte bara om omfattningen av HBV-specifika CD4 T-cells svar utan också om funktionella delmängder av HBV-specifika CD4 T celler. Nya metoder, såsom transkriptomik och metabolomikanalys, kan ge mer detaljerad funktionell information om HBV-specifika CD4 T-celler. Dessa metoder kräver vanligtvis isolering av livskraftiga HBV-specifika CD4 T-celler baserat på peptid-stora histocompatibility komplexa II multimers, medan för närvarande informationen om HBV-specifika CD4 T-cells epitopes är begränsad. Baserat på en HBV-härledd peptidmatris har en metod utvecklats för att utvärdera HBV-specifika CD4 T-cellssvar och identifiera HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper samtidigt med hjälp av perifera blodmonukleära cellprover från kroniska HBV- infektionspatienter.
För närvarande finns det 3 huvudmetoder för att analysera antigenspecifika T-celler. Det första tillvägagångssättet är baserat på interaktionen mellan T-cellsreceptorn och peptiden (epitopen). Antigen-specifika T celler kan vara direkt färgas med peptid-stora histocompatibility komplexa (MHC) multimers. Fördelen med denna metod är att den kan erhålla livskraftiga antigenspecifika T-celler, lämpliga för nedströms transkriptomik/metabolomikanalys. En begränsning av denna metod är att den inte kunde ge information om hela T-cellssvaret på ett specifikt antigen, eftersom det kräver validerade epitoppeptider medan antalet identifierade epitoper för ett specifikt antigen är begränsat för tillfället. Jämfört med hepatit B-virus (HBV)-specifika CD8 T-cellsepotoper har färre HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper identifierats1,2, vilket gjorde denna metod mindre tillämplig för analys av HBV-specifika CD4 T-celler för närvarande.
Det andra tillvägagångssättet är baserat på uppreglering av en serie aktivering-inducerade markörer efter antigenpeptidstimulering3. De vanliga markörerna inkluderar CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Denna metod har nu använts för att analysera antigenspecifika T-cellssvar hos vaccinerade individer5,6, Human Immunodeficiency Virusinfektionspatienter7, och svår akut respiratorisk syndrom Coronavirus 2 infektionspatienter8,9. Till skillnad från den peptid-MHC multimers baserade analysen, är denna metod inte begränsad av validerade epitoper och kan erhålla livskraftiga celler för nedströms analys. En begränsning av denna metod är att den inte kunde ge information om cytokinprofilen för antigenspecifika T-celler. Uttrycket av dessa aktiveringsinducerade markörer av vissa aktiverade antigen-icke-specifika celler kan också bidra till bakgrundssignalerna i analysen, vilket kan vara ett problem, särskilt när de mål antigenspecifika T-cellerna är sällsynta. För närvarande finns det begränsad tillämpning av denna metod på HBV-specifika CD4 T-celler4. Huruvida denna metod kan användas för att analysera HBV-specifika CD4 T-celler på ett tillförlitligt sätt behöver ytterligare undersökning.
Det tredje tillvägagångssättet är baserat på cytokinsekretion efter antigenpeptidstimulering. Liksom aktiveringsinducerad markörbaserad analys begränsas denna metod inte av validerade epitoper. Denna metod kan direkt avslöja cytokin profilen för antigen-specifika T celler. Känsligheten för denna metod är lägre än den aktiveringsinducerade markörbaserade metoden eftersom den förlitar sig på cytokinsekretion av antigenspecifika T-celler och antalet cytokiner som testas är vanligtvis begränsat. För närvarande används denna metod ofta vid analys av HBV-specifika T-celler. Eftersom cytokin som utsöndrar HBV-specifika T-celler knappast kunde detekteras genom direkt ex vivopeptidstimulering10,11, analyseras cytokinprofilen för HBV-specifika T-celler vanligtvis efter 10-dagars in vitropeptid stimulerad expansion12,13,14,15,16. Arrangemang av peptidpooler i matrisform har använts för att underlätta identifiering av antigenspecifikaepitoper 17,18. Med kombinationen av peptidmatris och cytokinutsöndringsanalys har en metod utvecklats för att utvärdera HBV-specifika CD4 T-cellssvar och identifiera HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper samtidigt16. I det här protokollet beskrivs detaljerna för den här metoden. HBV core antigen väljs som ett exempel på demonstration i detta protokoll.
De mest kritiska stegen i det här protokollet listas på följande sätt: 1) tillräckligt många PBMCs med hög lönsamhet för att starta PBMCs-expansion; 2) Lämplig miljö för utbyggnad av pbmcs. och 3) fullständigt avlägsnande av kvarvarande peptidpooler i PBMCs-kulturen före epitopidentifiering.
All analys i detta protokoll beror på den robusta spridningen av CD4 T-celler. I allmänhet kommer antalet PBMCs efter 10 dagars expansion att vara 2-3 gånger av det ursprungliga antalet. …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) och Chinese Key
Projekt specialiserat för infektionssjukdomar (2018ZX10723203).
Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
Haemocytometer | Brand | 718620 | |
HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |