Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina del pollo ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo importante en la neurobiología del desarrollo, con ventajas que incluyen su gran tamaño, rápido desarrollo y accesibilidad para la visualización y las manipulaciones experimentales. Sin embargo, su principal limitación técnica ha sido la falta de enfoques sólidos de pérdida de función para los análisis de la función génica. Este protocolo describe una metodología de silenciamiento génico en la retina de un pollo en desarrollo que implica la expresión transgénica de microARN artificiales (miARN) mediante el uso del sistema de transposones Tol2. En este enfoque, se introduce en la retina embrionaria de un pollo un plásmido de transposón Tol2 que contiene un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y secuencias artificiales de pre-miRNA contra un gen diana con una construcción de expresión de transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo . En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que la expresión de Nel, una glicoproteína que ejerce múltiples funciones en el desarrollo neuronal, puede suprimirse significativamente en la retina del pollo en desarrollo mediante el uso de esta técnica. Nuestros resultados indican que esta metodología induce una supresión estable y robusta de la expresión génica y, por lo tanto, proporciona un enfoque eficiente de pérdida de función para estudios del desarrollo de la retina.
Introducción
La retina de los vertebrados es un importante sistema modelo para estudiar el desarrollo neuronal. A pesar de su ubicación periférica, la retina es anatómica y evolutivamente una extensión del sistema nervioso central, y el nervio óptico, que consiste en axones de células ganglionares de la retina, representa un tracto dentro del sistema nervioso central. La retina del pollito tiene ventajas significativas como sistema modelo para estudiar el mecanismo molecular del desarrollo neuronal: es grande y se desarrolla rápidamente; tiene similitudes estructurales y funcionales con la retina humana; Es muy accesible para la visualización y las manipulaciones experimentales. L....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Construcción de vectores de expresión de miRNA
NOTA: Los procedimientos para construir vectores de expresión de miARN (pasos 1.1-1.3, 1.5-1.6.) están optimizados para el kit de expresión de miARN, kit de expresión de ARN miR Block-iT Pol II con EmGFP, como se describió anteriormente15,16. El kit proporciona el vector de expresión diseñado para permitir la expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vector de control (plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reactivos accesorios e instrucciones para producir vectores de expresión de miARN (ver
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Construcción de construcciones de transposones Tol2 para la expresión de miRNAs artificiales frente a Nel
El Nel (factor de crecimiento pidérmico Neural E(EGF)-Like; también conocido como Nell2) es una glicoproteína extracelular. Tiene similitudes estructurales con la trombospondina-1 y se expresa predominantemente en el sistema nervioso20,21. Hemos demostrado previamente que el Nel regula la diferenciación y la superviven.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo proporciona una guía detallada para el silenciamiento génico en la retina del pollo en desarrollo mediante la expresión transgénica de miRNAs artificiales utilizando electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2.
Los siguientes factores son de vital importancia para realizar esta técnica con éxito. En primer lugar, es fundamental utilizar secuencias de miARN que se haya confirmado que ejercen efectos de derribo sólidos. Antes de aplicarlos para la electropora.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los vectores pT2K-CAGGS y pCAGGS-T2TP fueron amablemente proporcionados por Yoshiko Takahashi (Universidad de Kioto, Kioto, Japón) y Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japón), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por su lectura crucial del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Royal Society y el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (Reino Unido) a M.N.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja de 18 G, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A y AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 y Q202 | Vectores de plásmidos para la fabricación de proteínas de fusión AP (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | Una herramienta en línea para elegir secuencias diana y diseñar secuencias pre-miRNA (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Cables Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Tubos capilares con fibra de punto omega (agujas de micropipeta) | FHC | 30-30-1 | 1 mm D.O. 0,75 mm D.I. |
| Electroporador de onda cuadrada CUY21 | Nepa Gene | CUY21 | |
| Dietanolamina (pH 9,8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Microscopio | |||
| Huevo incubadora | Kurl | B-Lab-600-110 | |
| https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html Portaelectrodos | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodos | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Células electrocompetentes de E. coli |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus) | Obtenidos de proveedores comerciales (por ejemplo, Charles River) o agricultores | ||
| luz de fibra de cuello de cisne | |||
| Reactivo de transfección FuGene 6 Promega | E2691 | ||
| Jeringa Hamilton (50 μ L) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Solución salina equilibrada de Hanks | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Aceite mineral pesado | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-homoarginina | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulador | Narishige (Japón) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Extractor de micropipetas | Instrumento de obturación | P97 | |
| p-Nitrofenilfosfato | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Plásmido de expresión de la transposasa Tol2. Un generoso y amable regalo de Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Japón). También disponible en Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Opcional) | Sistema | microinyección a presión | |
| Kit de maxi plásmido | Qiagen | 12163 | Kit de maxiprep de plásmido |
| vector pT2K-CAGGS Vector | de transposón Tol2. Amablemente proporcionado por Yoshiko Takahashi (Universidad de Kioto, Japón) | ||
| Tubo de PVC | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| El kit de expresión de ARN BLOCK-iT Pol II miR con EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contiene el vector de expresión de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vector de control (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plásmido de control negativo), reactivos accesorios e instrucciones (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Termociclador |
Referencias
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
