Summary

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

Published: May 18, 2022
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Summary

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Abstract

La retina del pollo ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo importante en la neurobiología del desarrollo, con ventajas que incluyen su gran tamaño, rápido desarrollo y accesibilidad para la visualización y las manipulaciones experimentales. Sin embargo, su principal limitación técnica ha sido la falta de enfoques sólidos de pérdida de función para los análisis de la función génica. Este protocolo describe una metodología de silenciamiento génico en la retina de un pollo en desarrollo que implica la expresión transgénica de microARN artificiales (miARN) mediante el uso del sistema de transposones Tol2. En este enfoque, se introduce en la retina embrionaria de un pollo un plásmido de transposón Tol2 que contiene un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y secuencias artificiales de pre-miRNA contra un gen diana con una construcción de expresión de transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo . En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que la expresión de Nel, una glicoproteína que ejerce múltiples funciones en el desarrollo neuronal, puede suprimirse significativamente en la retina del pollo en desarrollo mediante el uso de esta técnica. Nuestros resultados indican que esta metodología induce una supresión estable y robusta de la expresión génica y, por lo tanto, proporciona un enfoque eficiente de pérdida de función para estudios del desarrollo de la retina.

Introduction

La retina de los vertebrados es un importante sistema modelo para estudiar el desarrollo neuronal. A pesar de su ubicación periférica, la retina es anatómica y evolutivamente una extensión del sistema nervioso central, y el nervio óptico, que consiste en axones de células ganglionares de la retina, representa un tracto dentro del sistema nervioso central. La retina del pollito tiene ventajas significativas como sistema modelo para estudiar el mecanismo molecular del desarrollo neuronal: es grande y se desarrolla rápidamente; tiene similitudes estructurales y funcionales con la retina humana; Es muy accesible para la visualización y las manipulaciones experimentales. Los mecanismos moleculares de proliferación y diferenciación celular, morfogénesis y guía de axones durante el desarrollo neuronal se han estudiado ampliamente mediante el uso de la retina de pollo.

La electroporación in ovo se ha utilizado con éxito durante las últimas dos décadas para introducir genes ectópicos en las células del embrión de pollo en desarrollo. Esta técnica permite el marcaje de las células en desarrollo, el rastreo del destino celular y el rastreo de la migración celular y los tractos axónicos, así como la expresión génica ectópica para el análisis in vivo de la función génica. Las condiciones de electroporación in ovo para la expresión génica ectópica eficiente en embriones de pollo han sido bien establecidas 1,2,3.

A pesar de estas ventajas, la falta de una técnica estable de pérdida de función para el estudio de la función génica había sido una limitación técnica importante del embrión de pollo. Mientras que los embriones de pollo electroporados con pequeños ARN interferentes (siRNAs)4 o vectores de expresión de ARN de horquilla corta (shRNAs)5 muestran la eliminación del gen objetivo, la supresión génica en esos enfoques es transitoria porque los efectos desaparecen una vez que las células pierden los ARN o ADN introducidos. Se puede lograr una supresión génica más estable mediante la administración de siRNAs en embriones de pollo mediante un sistema de retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. El vector viral se integra en el genoma del huésped y los genes ectópicos se expresan de manera estable. Sin embargo, el retrovirus solo puede integrarse en el genoma de las células en división durante la fase mitótica (M) del ciclo celular, lo que puede imponer una limitación en las etapas de desarrollo y/o tipos de células para las que se puede aplicar este enfoque de pérdida de función. Además, la expresión de transgenes por RCAS parece más lenta y menos robusta que la inducida por electroporación in ovo 7.

Los transposones son elementos genéticos que se mueven de un lugar del genoma a otro. El elemento Tol2 es un miembro de la familia de elementos transponibles hAT y contiene un gen interno que codifica una transposasa que cataliza la reacción de transposón del elemento Tol28. Cuando un vector plásmido que lleva un casete de expresión génica flanqueado por las secuencias de los extremos izquierdo y derecho de los elementos Tol2 (200 pb y 150 pb, respectivamente) se introduce en células de vertebrados con una construcción de expresión de transposasa Tol2, el casete de expresión se extirpa del plásmido y se integra en el genoma del huésped, lo que favorece una expresión estable del gen ectópico (Figura 1). Se ha demostrado que el elemento transponible Tol2 puede inducir la transposición de genes de manera muy eficiente en diferentes especies de vertebrados, incluidos el pez cebra9,10, las ranas 11, los polluelos 12 y los ratones 13, y por lo tanto es un método útil de transgénesis y mutagénesis insercional. El sistema de transposones Tol2 se ha utilizado con éxito para la eliminación condicional de un gen diana mediante la integración genómica del siRNA que se procesa a partir de ARN bicatenariolargo 14.

Este protocolo describe un abordaje de pérdida de función en el embrión de pollo que implica la introducción de microRNAs artificiales (miRNAs) por el sistema de transposones Tol215,16. En este enfoque, se clona un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y miARN artificiales contra un gen diana en un vector de transposón Tol2. A continuación, la construcción del transposón Tol2 se introduce en la retina del pollito embrionario con una construcción de expresión de la transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo. En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestros estudios previos, logramos reducir la expresión de Nel, una glicoproteína extracelular que se expresa predominantemente en el sistema nervioso, en la retina del pollo en desarrollo (ver Resultados representativos). Nuestros resultados indican que se puede lograr una supresión génica estable y eficiente in ovo mediante esta técnica.

Protocol

1. Construcción de vectores de expresión de miRNA NOTA: Los procedimientos para construir vectores de expresión de miARN (pasos 1.1-1.3, 1.5-1.6.) están optimizados para el kit de expresión de miARN, kit de expresión de ARN miR Block-iT Pol II con EmGFP, como se describió anteriormente15,16. El kit proporciona el vector de expresión diseñado para permitir la expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vect…

Representative Results

Construcción de construcciones de transposones Tol2 para la expresión de miRNAs artificiales frente a NelEl Nel (factor de crecimiento pidérmico Neural E(EGF)-Like; también conocido como Nell2) es una glicoproteína extracelular. Tiene similitudes estructurales con la trombospondina-1 y se expresa predominantemente en el sistema nervioso20,21. Hemos demostrado previamente que el Nel regula la diferenciación y la supe…

Discussion

Este protocolo proporciona una guía detallada para el silenciamiento génico en la retina del pollo en desarrollo mediante la expresión transgénica de miRNAs artificiales utilizando electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2.

Los siguientes factores son de vital importancia para realizar esta técnica con éxito. En primer lugar, es fundamental utilizar secuencias de miARN que se haya confirmado que ejercen efectos de derribo sólidos. Antes de aplicarlos para la ele…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los vectores pT2K-CAGGS y pCAGGS-T2TP fueron amablemente proporcionados por Yoshiko Takahashi (Universidad de Kioto, Kioto, Japón) y Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japón), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por su lectura crucial del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Royal Society y el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (Reino Unido) a M.N.

Materials

18 G needle, 2" VWR 89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B GenHunter Corp Q201 and Q202 Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer Invitrogen An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg Sigma-Aldrich A2153
C115CB cables Sonidel C115CB https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables Sonidel C117 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) FHC 30-30-1 1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator Nepa Gene CUY21
Diethanolamine (pH 9.8) Sigma-Aldrich D8885
Dissecting microscope
Egg incubator Kurl B-Lab-600-110 https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder Sonidel CUY580 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes Nepa Gene CUY611P3-1 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B Invitrogen 18290-015 Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF Sigma-Aldrich F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent Promega E2691
Hamilton syringe (50 μL) Sigma-Aldrich 20715 Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution Sigma-Aldrich H6648
Heavy mineral oil Sigma-Aldrich 330760
HEPES GIBCO 15630080
L-Homoarginine Sigma-Aldrich H10007
MgCl2 Sigma-Aldrich 13112
Micromanipulator Narishige (Japan) MM3 http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller Shutter Instrument P97
p-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich 20-106
PBS Sigma-Aldrich D8662
pCAGGS-T2TP vector Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu ThermoFisher F566S
Picospritzer (Optional) Parker Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit Qiagen 12163 Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing VWR (UK) 228-3830
Spectinomycin Sigma-Aldrich S9007-5
T4 DNA ligase Promega M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP Invitrogen K493600 Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler

References

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Cite This Article
Nakamoto, C. M., Nakamoto, M. Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs. J. Vis. Exp. (183), e62399, doi:10.3791/62399 (2022).

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