Summary

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

Published: May 18, 2022
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Summary

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abstract

A retina de pintinhos tem sido um importante sistema modelo em neurobiologia do desenvolvimento, com vantagens que incluem seu grande tamanho, rápido desenvolvimento e acessibilidade para visualização e manipulações experimentais. No entanto, sua principal limitação técnica tem sido a falta de abordagens robustas de perda de função para análises de função gênica. Este protocolo descreve uma metodologia de silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento que envolve a expressão transgênica de microRNAs artificiais (miRNAs) usando o sistema transposon Tol2. Nesta abordagem, um plasmídeo transposon Tol2 que contém um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e sequências artificiais de pré-miRNA contra um gene alvo é introduzido na retina embrionária de pintinhos com uma construção de expressão de transposase de Tol2 por eletroporação in ovo . Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nosso estudo anterior, demonstramos que a expressão de Nel, uma glicoproteína que exerce múltiplas funções no desenvolvimento neural, pode ser significativamente suprimida na retina de pintinhos em desenvolvimento usando esta técnica. Nossos resultados indicam que esta metodologia induz uma supressão estável e robusta da expressão gênica e, portanto, fornece uma abordagem eficiente de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina.

Introduction

A retina de vertebrados é um importante sistema modelo para o estudo do desenvolvimento neural. Apesar de sua localização periférica, a retina é anatômica e em desenvolvimento uma extensão do sistema nervoso central, e o nervo óptico, que consiste em axônios de células ganglionares da retina, representa um trato dentro do sistema nervoso central. A retina de pintinhos tem vantagens significativas como um sistema modelo para estudar o mecanismo molecular do desenvolvimento neural: é grande e se desenvolve rapidamente; tem semelhanças estruturais e funcionais com a retina humana; É altamente acessível para visualização e manipulações experimentais. Mecanismos moleculares de proliferação e diferenciação celular, morfogênese e orientação axonal durante o desenvolvimento neural têm sido extensivamente estudados usando a retina de galinha.

A eletroporação in ovo tem sido utilizada com sucesso nas últimas duas décadas para introduzir genes ectópicos em células do embrião de pintinhos em desenvolvimento. Esta técnica permite a marcação de células em desenvolvimento, o rastreamento do destino celular e o rastreamento da migração celular e dos tratos axonais, bem como a expressão gênica ectópica para análise in vivo da função gênica. As condições de eletroporação in ovo para a expressão gênica ectópica eficiente em embriões de pintinhos estão bem estabelecidas 1,2,3.

Apesar dessas vantagens, a falta de uma técnica estável de perda de função para estudos da função gênica tem sido uma grande limitação técnica do embrião de pintinho. Enquanto embriões de pintinhos eletroporados com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)4 ou vetores de expressão para RNAs curtos (shRNAs)5 apresentam knockdown do gene alvo, a supressão gênica nessas abordagens é transitória porque os efeitos desaparecem quando as células perdem os RNAs ou DNAs introduzidos. Uma supressão gênica mais estável pode ser obtida pela entrega de siRNAs em embriões de pintos por um sistema de retrovírus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. O vetor viral integra-se ao genoma do hospedeiro, e os genes ectópicos são expressos de forma estável. No entanto, o retrovírus só pode se integrar ao genoma de células em divisão durante a fase mitótica (M) do ciclo celular, o que pode impor uma limitação nos estágios de desenvolvimento e/ou tipos celulares para os quais essa abordagem de perda de função pode ser aplicada. Além disso, a expressão de transgenes por RCAS parece mais lenta e menos robusta do que a induzida pela eletroporação in ovo 7.

Transposons são elementos genéticos que se movem de um local no genoma para outro. O elemento Tol2 é um membro da família de elementos transponíveis hAT e contém um gene interno que codifica uma transposase que catalisa a reação de transposon do elemento Tol28. Quando um vetor plasmidial que carrega um de expressão gênica flanqueado pelas sequências das extremidades esquerda e direita dos elementos Tol2 (200 pb e 150 pb, respectivamente) é introduzido em células vertebradas com uma construção de expressão de transposase de Tol2, o de expressão é extirpado do plasmídeo e integrado ao genoma do hospedeiro, o que suporta uma expressão estável do gene ectópico (Figura 1). Tem sido demonstrado que o elemento transponível Tol2 pode induzir a transposição gênica de forma muito eficiente em diferentes espécies de vertebrados, incluindo zebrafish9,10, rãs 11, pintos 12 e camundongos 13, sendo, portanto, um método útil de transgênese e mutagênese insercional. O sistema transposon Tol2 tem sido usado com sucesso para knockdown condicional de um gene alvo por integração genômica de siRNA que é processado a partir de RNA de fita dupla longa14.

Este protocolo descreve uma abordagem de perda de função no embrião de pintinho que envolve a introdução de microRNAs artificiais (miRNAs) pelo sistema transposon Tol215,16. Nesta abordagem, um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e miRNAs artificiais contra um gene alvo é clonado em um vetor transposon Tol2. A construção transposon Tol2 é então introduzida na retina embrionária de pintos com uma construção de expressão transposase Tol2 por eletroporação in ovo. Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nossos estudos anteriores, derrubamos com sucesso a expressão de Nel, uma glicoproteína extracelular predominantemente expressa no sistema nervoso, na retina de pintinhos em desenvolvimento (ver Resultados Representativos). Nossos resultados indicam que a supressão gênica estável e eficiente pode ser alcançada em ovo por esta técnica.

Protocol

1. Construção de vetores de expressão de miRNA NOTA: Os procedimentos para a construção de vetores de expressão de miRNA (etapas 1.1-1.3, 1.5-1.6.) são otimizados para o kit de expressão de miRNA, Block-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP, conforme descrito anteriormente15,16. O kit fornece o vetor de expressão projetado para permitir a expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), um vetor de controle …

Representative Results

Construção de construtos de transposon Tol2 para expressão de miRNAs artificiais contra NelNel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; também conhecido como Nell2) é uma glicoproteína extracelular. Apresenta semelhanças estruturais com a trombospondina-1 e é predominantemente expressa no sistema nervoso20,21. Demonstramos anteriormente que o Nel regula a diferenciação e a sobrevivência das células ganglion…

Discussion

Este protocolo fornece um guia detalhado para o silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento pela expressão transgênica de miRNAs artificiais usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2.

Os seguintes fatores são de fundamental importância para a realização bem-sucedida desta técnica. Primeiro, é fundamental usar sequências de miRNA que são confirmadas para exercer efeitos knockdown robustos. Antes de aplicá-los para eletroporação in ov…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os vetores pT2K-CAGGS e pCAGGS-T2TP foram gentilmente cedidos por Yoshiko Takahashi (Universidade de Kyoto, Kyoto, Japão) e Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japão), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por sua leitura crucial do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Reino Unido) para M.N.

Materials

18 G needle, 2" VWR 89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B GenHunter Corp Q201 and Q202 Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer Invitrogen An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg Sigma-Aldrich A2153
C115CB cables Sonidel C115CB https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables Sonidel C117 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) FHC 30-30-1 1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator Nepa Gene CUY21
Diethanolamine (pH 9.8) Sigma-Aldrich D8885
Dissecting microscope
Egg incubator Kurl B-Lab-600-110 https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder Sonidel CUY580 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes Nepa Gene CUY611P3-1 https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B Invitrogen 18290-015 Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF Sigma-Aldrich F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent Promega E2691
Hamilton syringe (50 μL) Sigma-Aldrich 20715 Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution Sigma-Aldrich H6648
Heavy mineral oil Sigma-Aldrich 330760
HEPES GIBCO 15630080
L-Homoarginine Sigma-Aldrich H10007
MgCl2 Sigma-Aldrich 13112
Micromanipulator Narishige (Japan) MM3 http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller Shutter Instrument P97
p-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich 20-106
PBS Sigma-Aldrich D8662
pCAGGS-T2TP vector Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu ThermoFisher F566S
Picospritzer (Optional) Parker Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit Qiagen 12163 Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing VWR (UK) 228-3830
Spectinomycin Sigma-Aldrich S9007-5
T4 DNA ligase Promega M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP Invitrogen K493600 Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler

References

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Cite This Article
Nakamoto, C. M., Nakamoto, M. Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs. J. Vis. Exp. (183), e62399, doi:10.3791/62399 (2022).

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