Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels
Summary
Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.
Abstract
La rétine du poussin est depuis longtemps un système modèle important en neurobiologie du développement, avec des avantages tels que sa grande taille, son développement rapide et son accessibilité pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Cependant, sa principale limite technique était l’absence d’approches robustes de perte de fonction pour les analyses de la fonction des gènes. Ce protocole décrit une méthodologie de silençage génique dans la rétine du poussin en développement qui implique l’expression transgénique de microARN artificiels (miARN) à l’aide du système de transposon Tol2. Dans cette approche, un plasmide transposon Tol2 contenant une cassette d’expression pour le marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des séquences artificielles de pré-miARN contre un gène cible est introduit dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo . Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans notre étude précédente, nous avons démontré que l’expression de Nel, une glycoprotéine qui exerce de multiples fonctions dans le développement neuronal, peut être supprimée de manière significative dans la rétine du poussin en développement en utilisant cette technique. Nos résultats indiquent que cette méthodologie induit une suppression stable et robuste de l’expression des gènes et fournit ainsi une approche efficace de la perte de fonction pour les études du développement rétinien.
Introduction
La rétine des vertébrés est un système modèle important pour l’étude du développement neuronal. Malgré son emplacement périphérique, la rétine est anatomiquement et développementalement une extension du système nerveux central, et le nerf optique, qui se compose d’axones de cellules ganglionnaires rétiniennes, représente un tractus dans le système nerveux central. La rétine du poussin présente des avantages significatifs en tant que système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire du développement neuronal : elle est grande et se développe rapidement ; il présente des similitudes structurelles et fonctionnelles avec la rétine humaine ; Il est très accessible pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Les mécanismes moléculaires de la prolifération et de la différenciation cellulaires, de la morphogenèse et du guidage axonale au cours du développement neuronal ont été largement étudiés à l’aide de la rétine de poulet.
L’électroporation in ovo a été utilisée avec succès au cours des deux dernières décennies pour introduire des gènes ectopiques dans les cellules de l’embryon de poussin en développement. Cette technique permet de marquer les cellules en développement, de tracer le destin cellulaire et de tracer la migration cellulaire et les voies axonales, ainsi que l’expression ectopique des gènes pour l’analyse in vivo de la fonction des gènes. Les conditions de l’électroporation in ovo pour une expression ectopique efficace des gènes chez les embryons de poussins ont été bien établies 1,2,3.
Malgré ces avantages, l’absence d’une technique stable de perte de fonction pour l’étude de la fonction des gènes a été une limitation technique majeure de l’embryon de poussin. Alors que les embryons de poussins électroporés avec de petits ARN interférents (siRNAs)4 ou des vecteurs d’expression pour les ARN courts en épingle à cheveux (shRNAs)5 montrent l’inactivation du gène ciblé, la suppression des gènes dans ces approches est transitoire car les effets disparaissent une fois que les cellules perdent les ARN ou les ADN introduits. Une suppression génique plus stable peut être obtenue en délivrant des siRNA dans des embryons de poussin par un système rétrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. Le vecteur viral s’intègre dans le génome de l’hôte et les gènes ectopiques sont exprimés de manière stable. Cependant, le rétrovirus ne peut s’intégrer dans le génome des cellules en division que pendant la phase mitotique (M) du cycle cellulaire, ce qui peut imposer une limitation sur les stades de développement et/ou les types de cellules pour lesquels cette approche de perte de fonction peut être appliquée. De plus, l’expression des transgènes par RCAS apparaît plus lente et moins robuste que celle induite par l’électroporation in ovo 7.
Les transposons sont des éléments génétiques qui se déplacent d’un endroit à un autre du génome. L’élément Tol2 fait partie de la famille des éléments transposables hAT et contient un gène interne codant pour une transposase qui catalyse la réaction de transposon del’élément 8 de Tol2. Lorsqu’un vecteur plasmidique porteur d’une cassette d’expression génique flanquée des séquences des extrémités gauche et droite des éléments Tol2 (200 pb et 150 pb, respectivement) est introduit dans des cellules de vertébrés avec une construction d’expression de la transposase Tol2, la cassette d’expression est excisée du plasmide et intégrée dans le génome de l’hôte, ce qui favorise une expression stable du gène ectopique (Figure 1). Il a été démontré que l’élément transposable Tol2 peut induire la transposition de gènes de manière très efficace chez différentes espèces de vertébrés, y compris le poisson-zèbre9,10, les grenouilles 11, les poussins 12 et les souris 13, et constitue donc une méthode utile de transgénèse et de mutagenèse insertionnelle. Le système de transposons Tol2 a été utilisé avec succès pour l’inactivation conditionnelle d’un gène cible par intégration génomique de siRNA qui est traité à partir d’un long ARN double brin14.
Ce protocole décrit une approche de perte de fonction dans l’embryon de poussin qui implique l’introduction de microARN artificiels (miARN) par le système de transposons Tol215,16. Dans cette approche, une cassette d’expression du marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des miARN artificiels contre un gène cible est clonée dans un vecteur transposon Tol2. La construction du transposon Tol2 est ensuite introduite dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo. Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans nos études précédentes, nous avons réussi à inhiber l’expression de Nel, une glycoprotéine extracellulaire principalement exprimée dans le système nerveux, dans la rétine du poussin en développement (voir Résultats représentatifs). Nos résultats indiquent qu’une suppression génique stable et efficace peut être obtenue in ovo par cette technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit un guide détaillé sur le silençage génique dans la rétine du poussin en développement par l’expression transgénique de miARN artificiels à l’aide de l’électroporation in ovo et du système de transposon Tol2.
Les facteurs suivants sont d’une importance cruciale pour l’exécution réussie de cette technique. Tout d’abord, il est essentiel d’utiliser des séquences de miARN dont il est confirmé qu’elles exercent des effets de knockdown robu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les vecteurs pT2K-CAGGS et pCAGGS-T2TP ont été aimablement fournis par Yoshiko Takahashi (Université de Kyoto, Kyoto, Japon) et Koichi Kawakami (Institut national de génétique, Mishima, Japon), respectivement. Nous remercions Michael Berberoglu pour sa lecture cruciale du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Royal Society et du Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Royaume-Uni) à M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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