Tab af funktionsmetode i den embryonale chick nethinden ved hjælp af Tol2 transposon-medieret transgen ekspression af kunstige mikroRNA'er
Summary
Vi har udviklet en ny tab-af-funktion tilgang, der involverer introduktion og genomisk integration af kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoner ved hjælp af i ovo-elektroporation og Tol2-transposonsystemet. Denne teknik giver en robust og stabil genknockdown-metode til undersøgelser af genfunktion under udvikling.
Abstract
Kyllingens nethinden har længe været et vigtigt modelsystem inden for udviklingsneurobiologi med fordele, herunder dens store størrelse, hurtige udvikling og tilgængelighed til visualisering og eksperimentelle manipulationer. Den største tekniske begrænsning havde imidlertid været manglen på robuste tab-af-funktion-tilgange til genfunktionsanalyser. Denne protokol beskriver en metode til genhæmning i den udviklende chick retina, der involverer transgen ekspression af kunstige mikroRNA’er (miRNA’er) ved hjælp af Tol2 transposonsystemet. I denne tilgang indføres et Tol2-transposonplasmid, der indeholder en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige præ-miRNA-sekvenser mod et målgen i den embryonale chick retina med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo-elektroporation . I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA’er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelse har vi vist, at ekspressionen af Nel, et glycoprotein, der udøver flere funktioner i neural udvikling, kan undertrykkes signifikant i den udviklende chick nethinden ved hjælp af denne teknik. Vores resultater indikerer, at denne metode inducerer en stabil og robust undertrykkelse af genekspression og dermed giver en effektiv tab-af-funktion tilgang til studier af retinal udvikling.
Introduction
Hvirveldyrets nethinde er et vigtigt modelsystem til at studere neural udvikling. På trods af sin perifere placering er nethinden anatomisk og udviklingsmæssigt en forlængelse af centralnervesystemet, og synsnerven, der består af axoner af retinale ganglionceller, repræsenterer en kanal i centralnervesystemet. Kyllingens nethinden har betydelige fordele som modelsystem til at studere den molekylære mekanisme for neural udvikling: Den er stor og udvikler sig hurtigt; det har strukturelle og funktionelle ligheder med den menneskelige nethinden; Det er meget tilgængeligt for visualisering og eksperimentelle manipulationer. Molekylære mekanismer for celleproliferation og differentiering, morfogenese og axonvejledning under neural udvikling er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af kyllingens nethinden.
I ovo er elektroporation blevet anvendt med succes i løbet af de sidste to årtier til at indføre ektopiske gener i celler i det udviklende kyllingembryo. Denne teknik muliggør mærkning af udviklende celler, sporing af celleskæbne og sporing af cellemigration og axonkanaler samt ektopisk genekspression til in vivo-analyse af genfunktion. Betingelserne for in ovo elektroporation for effektiv ektopisk genekspression i kyllingembryoner er veletablerede 1,2,3.
På trods af disse fordele havde manglen på en stabil tab-af-funktion-teknik til undersøgelser af genfunktion været en stor teknisk begrænsning af kyllingeembryoet. Mens kyllingeembryoner elektroporeret med små interfererende RNA’er (siRNA’er)4 eller ekspressionsvektorer for korte hårnåle-RNA’er (shRNA’er)5 viser knockdown af det målrettede gen, er genundertrykkelse i disse tilgange forbigående, fordi virkningerne forsvinder, når cellerne mister de indførte RNA’er eller DNA’er. En mere stabil genundertrykkelse kan opnås ved at levere siRNA’er i kyllingembryoner af et RCAS (R-eplikation Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) lang terminal gentagelse (LTR) med en S-plice-acceptor) retrovirussystem6. Den virale vektor integreres i værtsgenomet, og de ektopiske gener udtrykkes stabilt. Imidlertid kan retrovirus kun integreres i genomet af delende celler under den mitotiske (M) fase af cellecyklussen, hvilket kan pålægge en begrænsning på udviklingsstadierne og / eller celletyperne, for hvilke denne tab-af-funktion-tilgang kan anvendes. Desuden forekommer ekspression af transgener ved RCAS langsommere og mindre robust end den, der induceres af in ovo elektroporation7.
Transposoner er genetiske elementer, der bevæger sig fra et sted på genomet til et andet. Tol2-elementet er medlem af hAT-transponerbar elementfamilie og indeholder et internt gen, der koder for en transposase, der katalyserer transposonreaktionen af Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor, der bærer en genekspressionskassette flankeret af sekvenserne i venstre og højre ende af Tol2-elementerne (henholdsvis 200 bp og 150 bp) indføres i hvirveldyrceller med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion, udskæres ekspressionskassetten fra plasmidet og integreres i værtsgenomet, hvilket understøtter en stabil ekspression af det ektopiske gen (figur 1). Det har vist sig, at det transponerbare Tol2-element kan inducere gentransponering meget effektivt i forskellige hvirveldyrarter, herunder zebrafisk9,10, frøer 11, kyllinger 12 og mus 13, og dermed er en nyttig metode til transgenese og insertionel mutagenese. Tol2-transposonsystemet er med succes blevet anvendt til betinget knockdown af et målgen ved genomisk integration af siRNA, der behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokol beskriver en tab-af-funktion tilgang i kyllingembryoet, der involverer introduktion af kunstige mikroRNA’er (miRNA’er) af Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilgang klones en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA’er mod et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2-transposonkonstruktionen introduceres derefter i den embryonale chick retina med en Tol2 transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo elektroporation. I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA’er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelser lykkedes det os at slå ekspressionen af Nel, et ekstracellulært glycoprotein, der overvejende udtrykkes i nervesystemet, ned i den udviklende chick retina (se repræsentative resultater). Vores resultater indikerer, at stabil og effektiv genundertrykkelse kan opnås i ovo ved denne teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en detaljeret vejledning til genhæmning i den udviklende chick retina ved transgen ekspression af kunstige miRNA’er ved anvendelse af i ovo elektroporation og Tol2 transposon systemet.
Følgende faktorer er af afgørende betydning for at udføre denne teknik med succes. For det første er det afgørende at bruge miRNA-sekvenser, der er bekræftet for at udøve robuste knockdown-effekter. Før du anvender dem til in ovo-elektroporation , skal du teste ind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorerne blev venligst leveret af henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans afgørende læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
