कृत्रिम माइक्रोआरएनए के टोल 2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके भ्रूण चूजा रेटिना में हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण
Summary
हमने एक नया लॉस-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोण विकसित किया है जिसमें ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके चूजे के भ्रूण में कृत्रिम माइक्रो-आरएनए अनुक्रमों का परिचय और जीनोमिक एकीकरण शामिल है। यह तकनीक विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए एक मजबूत और स्थिर जीन वध पद्धति प्रदान करती है।
Abstract
चिक रेटिना लंबे समय से विकासात्मक न्यूरोबायोलॉजी में एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रही है, जिसमें इसके बड़े आकार, तेजी से विकास और विज़ुअलाइज़ेशन और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए पहुंच सहित फायदे हैं। हालांकि, इसकी प्रमुख तकनीकी सीमा जीन फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए मजबूत हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण की कमी थी। यह प्रोटोकॉल विकासशील चूजा रेटिना में जीन साइलेंसिंग की एक पद्धति का वर्णन करता है जिसमें टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके कृत्रिम माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति शामिल है। इस दृष्टिकोण में, एक टोल 2 ट्रांसपोसन प्लास्मिड जिसमें ईएमजीएफपी (एमराल्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) मार्कर और एक लक्ष्य जीन के खिलाफ कृत्रिम प्री-एमआरएनए अनुक्रमों के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट होता है, को भ्रूण के चिक रेटिना में एक टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा पेश किया जाता है। ट्रांसक्रिप्टेड रेटिना कोशिकाओं में, ट्रांसपोसेस ट्रांसपोसन वेक्टर से अभिव्यक्ति कैसेट के छांटने और मेजबान गुणसूत्रों में इसके एकीकरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे एमआईआरएनए और ईएमजीएफपी प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति होती है। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया है कि नेल की अभिव्यक्ति, एक ग्लाइकोप्रोटीन जो तंत्रिका विकास में कई कार्य करता है, इस तकनीक का उपयोग करके विकासशील चिक रेटिना में काफी दबाया जा सकता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि यह पद्धति जीन अभिव्यक्ति के एक स्थिर और मजबूत दमन को प्रेरित करती है और इस प्रकार रेटिना विकास के अध्ययन के लिए एक कुशल हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण प्रदान करती है।
Introduction
कशेरुक रेटिना तंत्रिका विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। अपने परिधीय स्थान के बावजूद, रेटिना शारीरिक और विकासात्मक रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का विस्तार है, और ऑप्टिक तंत्रिका, जिसमें रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के अक्षतंतु होते हैं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर एक पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं। तंत्रिका विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में चिक रेटिना के महत्वपूर्ण फायदे हैं: यह बड़ा है और तेजी से विकसित होता है; इसमें मानव रेटिना के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समानताएं हैं; यह विज़ुअलाइज़ेशन और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए अत्यधिक सुलभ है। तंत्रिका विकास के दौरान कोशिका प्रसार और भेदभाव, मॉर्फोजेनेसिस और अक्षतंतु मार्गदर्शन के आणविक तंत्र का चिकन रेटिना का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है।
विकासशील चूजा भ्रूण में कोशिकाओं में एक्टोपिक जीन पेश करने के लिए पिछले दो दशकों में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। यह तकनीक विकासशील कोशिकाओं के लेबलिंग, सेल भाग्य अनुरेखण, और सेल माइग्रेशन और एक्सॉन ट्रैक्ट्स का पता लगाने के साथ-साथ जीन फ़ंक्शन के विवो विश्लेषण में एक्टोपिक जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। चूजा भ्रूण में कुशल अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन की स्थितियों को अच्छी तरह से स्थापित किया गया है 1,2,3.
इन फायदों के बावजूद, जीन फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए एक स्थिर हानि-ऑफ-फ़ंक्शन तकनीक की कमी चूजे के भ्रूण की एक प्रमुख तकनीकी सीमा थी। जबकि चूजे के भ्रूण को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 4 या शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (एसएचआरएनए) 5 के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है, लक्षित जीन का वध दिखाया जाता है, उन दृष्टिकोणों में जीन दमन क्षणिक होता है क्योंकि कोशिकाओं द्वारा पेश किए गए आरएनए या डीएनए को खोने के बाद प्रभाव गायब हो जाते हैं। एक अधिक स्थिर जीन दमन आरसीएएस (आरइप्लीकेशन सीओम्पेटेंट एवियन सारकोमा-ल्यूकोसिस वायरस (एएसएलवी) लॉन्ग टर्मिनल रिपीट (एलटीआर) के साथ एसप्लिस स्वीकर्ता के साथ) रेट्रोवायरस सिस्टम6 द्वारा चूजे के भ्रूण में एसआईआरएनए वितरित करके प्राप्त किया जा सकता है। वायरल वेक्टर मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है, और अस्थानिक जीन स्थिर रूप से व्यक्त किए जाते हैं। हालांकि, रेट्रोवायरस केवल सेल चक्र के माइटोटिक (एम) चरण के दौरान विभाजित कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत हो सकता है, जो विकास के चरणों और / या सेल प्रकारों पर एक सीमा लगा सकता है जिसके लिए इस हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, आरसीएएस द्वारा ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन7 द्वारा प्रेरित की तुलना में धीमी और कम मजबूत दिखाई देती है।
ट्रांसपोसन आनुवंशिक तत्व हैं जो जीनोम पर एक स्थान से दूसरे स्थान पर जाते हैं। टोल 2 तत्व एचएटी ट्रांसपोसेबल तत्व परिवार का एक सदस्य है और इसमें एक आंतरिक जीन एन्कोडिंग एक ट्रांसपोसेस होता है जो टोल 2 तत्व8 की ट्रांसपोसन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है। जब एक प्लास्मिड वेक्टर जो एक जीन अभिव्यक्ति कैसेट को वहन करता है, जो टोल 2 तत्वों (क्रमशः 200 बीपी और 150 बीपी) के बाएं और दाएं सिरों के अनुक्रमों से घिरा होता है, को टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ कशेरुक कोशिकाओं में पेश किया जाता है, तो अभिव्यक्ति कैसेट को प्लास्मिड से निकाला जाता है और मेजबान जीनोम में एकीकृत किया जाता है, जो एक्टोपिक जीन की एक स्थिर अभिव्यक्ति का समर्थन करता है (चित्रा 1; चित्र 1)।). यह दिखाया गया है कि टोल 2 ट्रांसपोसेबल तत्व विभिन्न कशेरुक प्रजातियों में जीन ट्रांसपोज़ेशन को बहुत कुशलता से प्रेरित कर सकता है, जिसमें जेब्राफिश9,10, मेंढक 11, चूजे12 और चूहे 13 शामिल हैं, और इस प्रकार ट्रांसजेनेसिस और सम्मिलन म्यूटेनेसिस का एक उपयोगी तरीका है। टोल 2 ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग सीआरएनए के जीनोमिक एकीकरण द्वारा एक लक्ष्य जीन के सशर्त वध के लिए सफलतापूर्वक किया गया है जो लंबे समय तक डबल-फंसे आरएनए14 से संसाधित होता है।
यह प्रोटोकॉल चूजे के भ्रूण में एक हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसमें टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम15,16 द्वारा कृत्रिम माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की शुरूआत शामिल है। इस दृष्टिकोण में, एक लक्ष्य जीन के खिलाफ ईएमजीएफपी (एमराल्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) मार्कर और कृत्रिम एमआईआरएनए के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट को टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में क्लोन किया जाता है। टोल 2 ट्रांसपोसन निर्माण को तब भ्रूण के चिक रेटिना में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ पेश किया जाता है। ट्रांसक्रिप्टेड रेटिना कोशिकाओं में, ट्रांसपोसेस ट्रांसपोसन वेक्टर से अभिव्यक्ति कैसेट के छांटने और मेजबान गुणसूत्रों में इसके एकीकरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे एमआईआरएनए और ईएमजीएफपी प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति होती है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने विकासशील चिक रेटिना में मुख्य रूप से तंत्रिका तंत्र में व्यक्त एक बाह्य ग्लाइकोप्रोटीन नेल की अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक गिरा दिया (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। हमारे परिणाम बताते हैं कि इस तकनीक द्वारा ओवो में स्थिर और कुशल जीन दमन प्राप्त किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके कृत्रिम एमआईआरएनए की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा विकासशील चिक रेटिना में जीन साइलेंसिंग के लिए एक विस्तृत मार्गदर्श?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGS और pCAGGS-T2TP वैक्टर क्रमशः योशिको ताकाहाशी (क्योटो विश्वविद्यालय, क्योटो, जापान) और कोइची कावाकामी (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जेनेटिक्स, मिशिमा, जापान) द्वारा प्रदान किए गए थे। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए माइकल बर्बेरोग्लू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को रॉयल सोसाइटी और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) (यूके) से एमएन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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